Összefoglalás

Kísérleteinkben két ökológiai és egészségügyi szempontból magas kockázatot jelentő cianobakteriális toxin, a fehérjeszintézist gátló cilindrospermopszin (CYN) és az 1 és 2A típusú protein foszfatázokat gátló mikrocisztin-LR (MCY-LR) növényi sejtekre gyakorolt citotoxikus hatásait vizsgáltuk. A CYN és a MCY állati sejtekben potens citotoxinok, interferálnak a kromatin szerkezettel, a mikrotubuláris és mikrofilamentális citoszkeletonnal, valamint a sejtosztódás folyamataival, emellett DNS károsító hatásuk van. A kisérleteinkhez a természetes vizekben is előforduló nádból (Phragmites australis) szövettenyésztéssel úton előállított axenikus növényeket használtunk (Máthé és mtsai, 2000). A nád a partmenti vizekben előforduló állományalkotó növény, amely kapcsolatba kerülhet a cianobakteriális toxinokkal. Vizsgálataink során a következő eredményekre jutottunk: Kimutattuk, hogy a CYN nagymértékben gátolja a gyökerek növekedését, az IC50 érték 0,5 μg ml-1 -nek adódott. Azonban a hajtások növekedését a CYN kevéssé befolyásolta, igen magas (20 µg ml-1) koncentrációban is csak mintegy 20 %-al csökkentette a hajtások hosszanti növekedését. A CYN a nádnövényekben védekezési reakciót, azaz stresszválaszt váltott ki, melynek egyik következménye, hogy az újonnan képződő gyökerek száma növekedett, amely feltehetően a detoxifikáció hatásfokát növeli. Emellett a CYN kezelt növények gyökereiben nekrotikus foltok képződtek és az aerenchimák sok helyen eltömődtek, igy csökkentve a toxin felvételét. A nekrotikus sejthalál mellett apoptózisra utaló folyamatokat is detektáltunk a rizodermiszben, a kéregparenchymában és az elágazási zónában. Nem zárhatjuk ki, hogy a CYN hatás következtében az apoptotikus folyamatokat nekrózis követte ugyanazokban a sejtekben: hasonló jelenséget leírtak már növényi sejtekben. Stresszválaszként értelmezhető továbbá, hogy a CYN a kortikális mikrotubuláris citoszkeleton reorientációját okozta a gyökerek elongációs zónájában. A differenciált sejtekben a CYN a mikrotubuláris rendszer denzitásának csökkenését okozta, amely némely esetben együtt járt a mikrotubulusok reorientációjával, azonban a leggyakrabban külön jelentkezett, így a két jelenség között nem lehet direkt összefüggést megállapítani. A kortikális mikrotubuláris citoszkeleton dezorganizációja a sejtek laterális expanzióját, és ezáltal a gyökércsúcsok megduzzadását okozta. A CYN a mitotikus apparátusok rendellenességeinek megjelenését indukálta az osztódó sejtekben. Jellegzetes CYN hatás volt a dupla, ill. hasadt preprofázisos kötegek megjelenése. Ezek a struktúrák nagy valószínűséggel összefüggésbe hozhatóak a cianotoxin fehérjeszintézis gátló hatásaival. Megfigyeltük továbbá a metafázis-anafázis orsók és a fragmoplaszt dezorganizációját a CYN kezelés hatására. Mitotikus rendellenességeket már 1 µg ml-1 CYN hatására megfigyeltünk, a CMT dezorganizációja 5 µg ml-1 CYN kezelés következtében jelentkezett. A CMT denzitás csökkenése és a hibás mitózisok hátterében a CYN protein szintézist gátló hatását gyanítjuk, ugyanis a szakirodalom tanúsága szerint számos a fehérjeszintézist gátló vegyület az általunk leírtakhoz hasonló elváltozást okozott (Mineyuki és mtsai, 1994, Baluska és mtsai, 1995). A CMT denzitásának csökkenése nem magyarázható a tubulin mennyiségének csökkenésével, ugyanis immunoblot vizsgálataink szerint a β-tubulin mennyisége a CYN hatására nőtt. A CYN a sejtciklus folyamatával is interferált, az összes mitózisok száma CYN kezelés hatására enyhén megnövekedett. A sejtciklus egyes stádiumait külön vizsgálva előtűnt, hogy a CYN hatására a profázisban lévő sejtek száma növekedett, míg a metafázisos sejtek aránya csökkent. A CYN sejtciklusra gyakorolt hatását a fehérjeszintézist gátló hatása magyarázhatja. A MCY-LR kezelt növényekben kimutattuk a kortikális mikrotubuláris citoszkeleton dezorganizációját, sok esetben pedig a CMT teljes eltűnését. Számos sejtben a CMT eltűnése mellett a citoplazma megnövekedett diffuz festődését láttuk, ezek alapján feltételezzük, hogy a MCY-LR a CMT depolimerizációját okozta. Megfigyeléseink szerint a MCY-LR hatására az osztódó sejtekben számos, a citoszkeletont érintő elváltozás jelent meg. A mitotikus orsó szerkezete megváltozott, sok sejtben hézagossá vált, gyakran jelentek meg tripoláris orsók. Sok sejtben megfigyeltük a fragmoplaszt szétesését. A MCY-LR a CYN-nel ellentétben nem okozott rendellenességeket a preprofázisos kötegben. A MCY-LR az állati rendszerekben MCY-LR és más protein foszfatáz inhibitorok esetén már megfigyelt dualisztikus választ váltott ki a nád gyökerekben. Hosszú távú toxinkezelések esetén, kis koncentrációban (0,1-5 µg ml-1) a sejtek osztódó képességének növekedését okozta, míg nagy koncentrációban (5-40 µg ml-1) alkalmazva gátolta azt. A MCY-LR megnövelte a mitotikus sejtek tartózkodási idejét a profázisban és a telofázisban. A MCY-LR mikrotubuláris citoszkeletonra és a sejtciklusra gyakorolt hatásainak hátterében az 1 és 2A típusú protein foszfatázok gátlása áll, a toxin nagy valószínűséggel a MAP kináz kaszkádokkal illetve a ciklin dependens kinázok hatásaival interferál, megnövelve a mikrotubulus asszociált proteinek foszforiláltsági állapotát. A CYN és a MCY-LR egyaránt apoptotikus folyamatokat indukált. A CYN számottevően nagyobb mértékben növelte az apoptotikus sejtek számát mint a MCY-LR. A CYN már 0,5 µg ml-1 koncentrációban növelte az apoptotikus TUNEL pozitív sejtek számát, míg MCY-LR esetén csak 2,5 µg ml-1 feletti koncentrációnál jelentkeztek szórványosan apoptotikus tünetek. A CYN-ból a sejt méregtelenítésében résztvevő enzimek hatására képződő toxikus metabolitok képesek a DNS-t károsítani, ezáltal apoptózist kiváltani. A MCY-LR apoptogén hatásai, feltehetőleg nem a protein foszfatáz gátlása miatt, hanem a MCY-LR szabadgyököt generáló képessége miatt jelentkeztek. Ez utóbbi csak közvetve hozható kapcsolatba a toxin indukált specifikus biokémiai hatásokkal. A jelen kísérleteinkben tapasztaltak egyértelműen alátámasztják azt, hogy a két cianotoxin, a CYN és a MCY-LR citotoxikus hatású a szövettenyészetekben előállított axenikus nádnövények sejtjeire.

English summary

Introduction The aim of this study was to investigate the cytotoxic effects of two cyanotoxins, the protein synthesis inhibitory cylindrospermopsin (CYN) and the protein phosphatase inhibitory microcystin-LR (MCY-LR) in cells of axenic tissue cultured Phragmites australis plantlets. The name cyanotoxin refers to a wide variety of toxic compounds, produced by the toxic strains of cyanobacterial species. These toxins represent high health and ecological risk, due to their potential to cause severe toxicity in humans, in livestock and other animals (Carmichael, 1994). There is growing evidence that cyanobacterial toxins can also affect plants. At this time only MCY and CYN have been reported to have toxic effects in plant systems (e.g. Kós et al. 1995; M-Hamvas et al. 2003, Pflugmacher 2004, Máthé et al. 2007, Vasas et al. 2002). MCY is a heptapeptide type cyanotoxin produced by several cyanobacteria (e.g. Microcystis aeruginosa, Anabaena sp., Nostoc sp. etc.), it is a potent inhibitor of type 1 and 2A protein phosphatases (Sivonnen and Jones 1999). The cytotoxic effects of MCY include disruption of actin microfilaments, intermediate filaments and microtubules, alteration of cell cycle and genotoxicity (Toivola and Eriksson 1999, Lankoff et al. 2003). CYN is an alkaloid type cyanotoxin produced by toxic strains of Cylindrospermopsis raciborskii and Aphanizomenon ovalisporum. It has also severe cytotoxic effects on animal cells. It has been reported to be genotoxic by its ability to create adducts on DNA molecules (Shaw et al 2000), disruption of actin micrafilaments and microtubules has also been demonstrated (Gácsi et al 2009). In plant cells it has been demonstrated that MCY can cause changes in chromatin sructure similar to apoptosis, but there is no other available data on its cytological effects (Yin et al. 2006). In the case of CYN, there are no literature data on its cytological effects in plants.

Goals of the study Considering the above mentioned statements, our goals were as follows: a. To investigate the effects of CYN on growth of axial organs in tissue culture derived axenic reed (Phragmites australis) plantlets. b. To show the histological alterations induced by CYN in roots of reed plantlets. c. Using fluorescence microscopy techniques, our aim was to study the changes induced by the protein synthesis inhibitor CYN and the protein phosphatase (1 and 2A) inhibitor MCY-LR in microtubular structures in interphase, differentiated and dividing cells and to detect changes in chromatin structure during cell division in reed roots. d. To show the effect of both cyanotoxins on the mitotic potential and cell cycle in reed root cells. e. To show the potential apoptogenic effect of CYN and MCY-LR in root cells via chromatin staining with DAPI and via TUNEL assay (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labeling).

Results and discussion a. We showed that CYN can severely inhibit the growth of reed roots with an IC50 value of 0,5 µg ml-1. In the case of shoots, the growth inhibition was much less pronounced. Even high doses (20 µg ml-1) of CYN only caused 20 % decline in the growth rate of reed shoots. CYN caused the increase of root number, which we considered as a stress reaction of plants to increase detoxification capacity (Kinnear, 2008). b. CYN had many histological effects in reed roots that can be considered as stress adaptation. Starting from 10 µg ml-1 concentration, CYN caused obturation of aerenchyma by callus-like tissue and necrotic cell death in the rhizodermis and in deeper tissues (in the case of differentiated root regions). These changes can decrease the translocation capacity of roots and thus protecting the other organs from toxic compounds (Armstrong and Armstrong 1999). It is worth mentioning that besides necrotic cell death we detected apoptosis-like processes in rhizodermis and cortex of CYN treated reed roots. It is likely that apoptotic-like chromatin changes were followed by necrotic cell death. c. CYN caused reorientation of cortical microtubular (CMT) structure in elongation zones of reed roots, the cells with reoriented microtubules switched from normal axis directed elongation, to radial expansion leading to thicker root tips. CMT reorientation and altered cell shape can be the effect of many stress factors that lead to decreased growth (Yuan et al. 1994), thus we can state that these reactions are part of the stress response. In interphase cells CYN also caused the decrease in the number of CMT bundles. The reduced number of microtubules in some cases was accompanied by CMT reorientation but in most cases it was not, so it is not likely to be any direct connection between these two effects. The changes in CMT structures were detectable starting from 5 µg ml-1 CYN. CYN induced anomalies in the cell division machinery of reed root cells. The most pronounced effect was the formation of double or split PPB-s during preprophase instead of normal PPB-s detected in control cells. CYN also caused formation of disrupted mitotic spindles and phragmoplasts and in some cases of tripolar spindles. The effects of CYN on mitosis related microtubular structures was visible starting from 0,5 µg ml-1. Control cells always contained normal prophases, metaphases and telophases. Other protein synthesis inhibitors caused similar changes in microtubular cytoskeleton both in interphase and mitotic cells (Mineyuki et al. 1994, Baluska et al. 1995), thus we consider that these changes are attributable to the protein synthesis inhibitory effect of CYN. Western blot analysis of β-tubulin content showed that instead of decreasing it, CYN caused elevated levels of β-tubulin that reacts with the polyclonal antibody raised against the C-terminal sequence of protein. Regarding, that the C-terminal region of both α- and β-tubulin proteins can be post-translationally modified (Smertenko et al. 1997a), we cannot state that CYN somehow induced the expression of β-tubulin. It is highly unlikely that CYN causes disruption of microtubular cytoskeleton by decrease in tubulin levels via protein synthesis inhibition. According to Mineyuki et al. (1994) it is more likely that these effects were due to decreased level of microtubule associated proteins. MCY-LR also caused alteration of microtubular cytoskeleton, in concentrations above 0,5 µg ml-1. In many interphase cells CMTs were disorganised or absent, these cells showed increased background fluorescence in the cytoplasm. The best explanation of these effects is that MCY caused the depolymerisation of microtubules. It is known that increased phosphorylation state of tubulins or MAPs leads to reduced stability of microtubules, which is highly important for the mitosis related microtubule reorganisations (Wright és Smith, 2007). The cells with disrupted microtubules could not grow unidirectionally, they were swollen. This is in accordance with the histological effects previously detected by our laboratory (Máthé et al. 2009). MCY-LR caused the appearence of mitotic anomalies, the mitotic spindle became less organised or disrupted, in some cases the formation of tripolar spindles was detected. The phragmoplast was also disrupted in some dividing cells. In contrast to CYN, MCY-LR did not cause the appearence of double or split PPB-s suggesting a different mode of action. In cells treated with other protein phosphatase 1 and 2A inhibitors similar alterations to our results were observed (Vasquez et al. 1999, Ayaydin et al. 2000). The cytoskeletal effects of MCY-LR were most likely due to its protein phosphatase inhibitory effect. d. CYN interfered with the cell cycle of reed root meristem cells. The effect of CYN was not pronounced when taking in account the mitotic indices, but when we examined the stages of mitosis separately we could show that CYN caused the increase in the percentage of cells in prophase, while the number of cells in metaphase decreased. Other protein synthesis inhibitors can cause blockage at both early prophase and telophase (De la Torre et al. 1989, Olszewska et al 1990, Nogami et al. 1996). We could not detect the complete arresting of mitosis in certain mitotic phases but it is highly probable that the cell cycle related effects of CYN were also caused by its protein synthesis inhibitory effect. The effect of MCY-LR on cell cycle was dualistic: at long-term exposure of reed plants, low levels of MCY-LR (0,1-5 µg ml-1) caused increase in number of dividing cells, while higher levels of the cyanotoxin caused the decrease of mitotic index. This type of dualistic response was also detected in MCY-LR treated CHO-K1 (mammalian) cells (Lankoff et al. 2003). Our laboratory showed for the first time this type of dualistic response in plant cells as a result of protein phosphatase 1 and 2A inhibitor treatment. MCY-LR increased the duration time of prophase and telophase. The effect of other phosphatase inhibitory compounds like endothall and okadaic acid in plant cells is similar to our results (Zhang et al. 1992, Ayaydin et al. 2000). e. Both CYN and MCY-LR could cause apoptosis-related processes in reed roots. The potential of CYN to induce apoptosis was higher than of MCY-LR. CYN caused the increase of the number of TUNEL positive nuclei as well as the number of cells with condensed chromatin starting from 0,5 µg ml-1 cyanotoxin concentration. In contrast, in the case of MCY-LR only a few cells were characterized by apoptosis related symptoms starting from 2,5 µg ml-1 cyanotoxin concentration. The apoptotic effect of CYN can be related to its ability to bind DNA. In plants, similarly to animals, DNA damaging agents cause apoptotic cell death (Danon and Galois 1998). In the case of MCY-LR its free radical generating potential might lay in the background of apoptogenic effect. As a conclusion we can now state that both CYN and MCY-LR are potent cytotoxins in cells of reed roots.