Egy ígéretes aszpergillózis elleni antimikotikum a PAF antifungális fehérje, melyet a fonalas aszkomikóta Penicillium chrysogenum gomba termel. Munkámban ezen fehérje cisztein mutánsait termeltettem P. pastoris-ban, továbbá előállítottam az 15N jelölt mutáns PAF antifungális fehérjét, NMR szerkezetvizsgálatok, és a jövőbeni biológiai hatástanulmányok számára. A PAF fehérje vizsgálata körülbelül 16 éve kezdődött. A szerkezeti vizsgálatokból tudjuk, hogy a PAF fehérjét öt jellegzetes b-lánc alkotja ortogonálisan elrendeződésben, melyeket három cisztein híd kapcsol össze. A tanulmányok során bebizonyosodott hogy a biológiai aktivitásához - azaz az érzékeny gombák növekedésének gátlásához - elengedhetetlen a diszulfid hidak jelenléte. Az azonban továbbra is kérdés maradt, hogy vajon a jellegzetes 3D térszerkezet kialakításában mi a szerepe a diszulfid hidaknak, valamint milyen topológiával létesíti a hat cisztein oldallánc a diszulfid hidakat. A diszulfid hidak helyzetének pontos meghatározása pusztán NMR mérésekkel nem volt lehetséges, ezért gondoltuk hogy három különböző cisztein mutáns előállításával ezekre a kérdésekre választ kaphatunk. Munkám első felében kidolgoztam a cisztein mutáns PAF fehérjék optimális heterológ expressziós körülményeit P. pastoris-ban. Ezen expressziós rendszer igen érzékeny, különös figyelmet kell fordítani az expressziós körülménynek pontos beállítására, így a munka során felhasznált különböző tápközegek összetételére és az élesztő optimális növekedési feltételeinek megteremtésére, állandó nyomon követésére, ellenőrzésére. Annak ellenére hogy az Invitrogen kitjét használtam[14], több esetben is apró módosításokra szükség volt ahhoz, hogy expressziót tudjak elérni. A kit-ben előírt növesztési idő legtöbb esetben 16-18 óra, tapasztalataink szerint azonban a megfelelő sejtszám elérése sok esetben több időt vett igénybe (18-30 óra). Ezen kívül a vektor genomba való többszörös beépülését ellenőrző geneticines szelekció során, nem a legmagasabb kópiaszámú klón bizonyult a legjobb fehérje termelőnek. A mutánsok sikeres teszt expressziója alapján kiválasztottam a legjobb kitermelést biztosító klónokat, és meghatároztam az expresszió ideális időtartamát. A nagyobb léptékű növesztés során ezeket az optimalizált körülményeket alkalmaztam. Az extracelluláris fehérje termelés előnye, hogy egyetlen kromatográfiás lépésben homogén PAF mutáns fehérjéket tudtam izolálni. Átlagosan 300 ml cisztein mutáns tenyészetből, 7mg tisztított és koncentrált fehérjét nyertem ki. Munkám második részében a 15N izotóp jelölés módszerét dolgoztam ki a Pichia expresszált cisztein mutáns PAF fehérjékre. Jelöletlen ammónium-szulfátos kísérlet elvégzésével vizsgáltam a külön adagolt nitrogén forrás fehérje kihozatalra gyakorolt hatását. Megállapítottam hogy az eredetiés a külön adagolt nitrogén forrás alkalmazása során nincs szignifikáns különbség a kihozatalban. Így a jelölt ammónium szulfát nitrogén forrás alkalmas a fehérje egyenletes izotópos jelölésére. A 15N izotópos jelölés kivitelezése a mutPAF-C7S és a mutPAF-C14S fehérjék esetén sikeres volt. Az NMR vizsgálatokat az alábbi fehérjéken végeztük el: (1) 1H-NMR vizsgálatot végeztünk heterológ expresszióval előállított három jelöletlen cisztein mutáns-PAF fehérjén (mutPAF-C7S, mutPAF-C14S,mutPAF-C54S), és a kapott spektrumokat összehasonlítottuk a PAF (P. pastoris) és a PAF (P. chrysogenum) 1H-NMR spektrumaival ; (2) egy éjszakás HSQC spektrumot mértünk az 15N mutPAF-C14S fehérjéről és összehasonlítottuk a 15N jelölt P. chrysogenum PAF HSQC spektrumával. A 1H-NMR eredményekből megállapítottuk, hogy a natív és a rekombináns PAF fehérje ugyanazon 3D szerkezettel bír. Azonban egyik cisztein mutáns fehérje sem rendelkezik a PAF-ra jellemző ortogonális béta redős szerkezettel, valamint hogy a PAF helyes feltekeredéséhez mind a három diszulfid-híd jelenléte esszenciális. A jelölt 15N mutáns fehérjék HSQC spektrum vizsgálata megerősítette a proton NMR eredményeit: a fehérjében nem alakultak ki a jellegzetes másodlagos szerkezeti elemek, ezért valószínű, hogy ha ki is alakultak diszulfid hidak, nem adnak felvilágosítást a natív fehérjében lévő diszulfid topológiáról. A fehérje pontos diszulfid-híd mintázatát ezen módszer segítségével nem lehetett megállapítani. Azonban a mutánsok biológiai hatásvizsgálatai jelenleg is folynak A. nidulans-on és A. niger-en. A hatásvizsgálatok alapján elmondható hogy a mutPAF-C54S a jellegzetes natív szerkezet kialakulása nélkül is 50%-ban gátolta az Aspergillus niger tenyészet növekedését. A mutánsok további biokémiai módszerrel való vizsgálatával, meg lehet állapítani az esetleges diszulfid hidak jelenlétét. Amennyiben jelen vannak diszulfid hidak a mutáns PAF fehérjében, tömegspektrometriás analízissel lehetőség van a helyének megállapítására proteázzal emésztett mintában. Egyértelmű eredménynek könyvelhetjük el a munka során azt a megállapítást, hogy mind a hat ciszteinnek jelen kell lennie ahhoz, hogy a diszulfid hidak, illetve a fehérje natív szerkezete kialakuljon. A diszulfid-híd problémakörének megoldására ezen kívül több lehetőség is kínálkozik. Többszörös cisztein mutánsok előállítása és NMR spektroszkópiás vizsgálata, szelenocisztein mutánsok létrehozása és szelén NMR-rel való elemzése. Ezen kívül megoldást jelenthet még a PAF kémiai szintézise és az egyes változatok tömegspektrometriás elemzése.