Expression and modulation of certain Nod-like receptors and their co-acting partners in macrophages and corneal epithelial cells

Absztrakt

In our work we described for the effect of RWE on the LPS-induced IL-1β secretion of macrophages. We demonstrated that RWE (in the presence of NADPH) has no significant effect on the secretion of IL-1β, neither in the primary macrophages, dendritic cells nor on the macrophage cell line THP-1 cells, but it has robust increasing effect on the LPS-induced IL-1β production in both of these cells. We have shown that whereas RWE alone (but not NADPH) induced some ROS production, their combined effect yielded a continuously increasing ROS level. Using ROS inhibitors, we have shown that the majority of the ROS involved in the RWE-dependent enhancement of LPS-induced IL-1β production is generated by pollen-derived NADPH oxidases. We have also shown that the increased production of IL-1β is NLRP3 inflammasome-mediated and caspase-1-dependent. We reported that RWE augments the LPS-induced gene expression of pro- and cleaved IL-1β, and also the key components of NLRP3 inflammasome. We have also shown the increased protein expression of pro- and cleaved caspase-1 and IL-1β. We have also reported that RWE induces the phosphorylation of p38 MAPK, JNK, furthermore, the phosphorylation appears to be NADPH-dependent. RWE in the presence of NADPH substantially enhances the LPS-induced p38 MAPK and JNK phosphorylation. We have also demonstrated that RWE induces the phosphorylation of AP-1 complex members c-Jun and c-Fos, which are also important participants of signaling pathways involved in IL-1β expression. The observed cooperation of RWE and LPS suggests that bacterial endotoxin contamination has an important role in the ragweed pollen-induced allergic reactions. In our second study we investigated the transcription pattern of Nod-like receptors and inflammasome components in primary human corneal epithelial cells and in HCE-T cell line. The transcription of NOD1, NOD2, NLRX1 and NLRP1 is similar in the primary cells and in the cell line. We found that the expression of NLRP3 and NLRP10 is higher in HCE-T cells, while ASC and caspase-1 show higher transcription levels in the primary cells. NLRC5 and NLRP7 are hardly detectable in any of these cell types. In our study we reported that while relatively short (6 hours) UV-B irradiation leads to the downregulation of both investigated NLRP and NOD mRNAs and also those of inflammasome components in HCE-T cells, longer incubation (24 hours) of the cells after UV-B exposure results in the recovery or upregulation of only the NLRP sensors. We have presented a short isoform of NLRP1 protein, whose expression changes in a similar way as that of RNA. However, the protein expression of NLRP3 was not detectable. Our group also detected – among all of the studied cytokines – only the presence of IL-6 from the supernatant of HCE-T cells. The secretion level of IL-6 is only increased in the sample 24 hours after UV-B irradiation, with the increase being twofold. UV-B is not able to induce the secretion of IL-1β. We have demonstrated that NOD1 and NOD2 are functionally active in HCE-T cells, enabling us to establish that HCE-T is a good corneal epithelial model system for NOD protein studies in the eye. As this model is highly suitable for further investigations, therefore it opens a new frontier in the development of new therapeutic approaches targeting eye-related infectious diseases. Munkánk során kimutattuk a parlagfű pollen kivonat hatását az LPS-indukált makrofágok IL-1β termelésére. Eredményeink szerint a parlagfű pollen kivonat (NADPH jelenlétében) nem befolyásolja szignifikánsan sem a primer humán makrofágok és dendritikus sejtek, sem a THP-1 makrofágok IL-1β termelését, azonban jelentősen fokozza ezen sejtek LPS-indukált IL-1β szekrécióját. Kimutattuk továbbá, hogy míg a parlagfű pollen kivonat – ellentétben a NADPH-val – önmagában is ROS termelést generál, együttesen fokozatosan növekvő mennyiségű ROS termelést váltanak ki a THP-1 sejtekben. Megállapítottuk, hogy a ROS, mely az LPS-indukált, pollen kivonat által tovább növelt IL-1β termelés során keletkezik, nagymértékben a parlagfű pollen-eredetű NADPH oxidáz enzim működésének következménye. Azt is kimutattuk, hogy a növekedett IL-1β szekréció NLRP3 és kaszpáz-1 enzim-dependens. A pollen kivonat tovább fokozza az LPS által indukált kaszpáz-1, valamint az IL-1β protein expresszióját is. Az IL-1β expressziójában fontos szereppel bíró jelátviteli útvonalak foszforilációs vizsgálatai során azt az eredményt kaptuk, hogy a parlagfű pollen kivonat NADPH-dependens módon indukálja a p38 MAPK és a JNK foszforilációját, valamint jelentősen növeli ezen fehérjék LPS által indukált foszforilációjának mértékét. A parlagfű pollen kivonat az AP-1 komplex c-Jun és c-Fos LPS-indukált foszforilációját is tovább növeli. A parlagfű pollen kivonat valamint az LPS kooperációja arra enged következtetni, hogy a pollen szemek bakteriális endotoxin „szennyezettsége” fontos szerepet játszhat a parlagfű pollen által kiváltott allergiás folyamatok kialakulásában. A disszertáció alapjául szolgáló másik munkánk során a Nod-like receptorok és az inflammoszómatagok expresszióját vizsgáltuk primer humán korneális epitél sejtekben és a HCE-T humán korneális epitél sejtvonalban. Megállapítottuk, hogy a NOD1, NOD2, NLRX1 és az NLRP1 mRNS hasonló mértékben expresszálódik mind a primer sejtekben, mind a sejtvonalban, azonban míg az NLRP2 és az NLRP10 a sejvonalban, az ASC és a kaszpáz- 1 a primer sejtekben fejeződik ki nagyobb mértékben. Az NLRC5 és az NLRP7 mRNS a detektálhatósági szint közelében fejeződik ki. Munkánk során kimutattuk, hogy UV-B sugárzás hatására a kezelés után 6 órával az általunk vizsgált NLRP és NLRC proteinek, valamint az inflammoszómatagok mRNS expressziója csökkent, míg az NLRP fehérjék mRNS kifejeződése az UV-B sugárzás után 24 órával újra elérte a nem-kezelt sejtekben mért szintet. Az NLRP3 és az NLRP10 esetében pedig magasabb expressziót mutattunk ki a kontrollhoz képest. Az NLRP1 protein kisebb molekulasúlyú izoformáját mutattuk ki a HCE-T sejtekben, melynek expressziója UV-B hatására az mRNS-éhez hasonlóan változik. Az NLRP3 fehérje jelenlétét nem tudtuk detektálni a HCE-T sejtvonalban. Az általunk vizsgált proinflammatórikus citokinek közül az IL-6 szekréciója mutatható ki a sejtek felülúszójából, melynek mennyisége az UV-B sugárzás hatására a kezelést követő 24 óra múlva nőtt. Megállapítottuk, hogy a korneális epitél sejtvonalban expresszálódó NOD1 és NOD2 funkcionálisan is aktív, így jó modell rendszert nyújthat a korneában található NOD proteinek vizsgálataihoz, melyek új teret nyithatnak a szemet érintő „danger szignál”-eredetű betegségek elleni új terápiás lehetőségek kidolgozásához.

Leírás
Kulcsszavak
Nod-like receptors, Nod-like receptorok, NLRP3 inflammasome, IL-1 production, reactive oxygen species, ragweed pollen, NADPH oxidase, macrophages, corneal epithelial cells, UV-B, NLRP3 inflammoszóma, IL-1β termelés, reaktív oxigén gyökök, parlagfű pollen, NADPH oxidáz, makrofágok, korneális epitél sejtek
Forrás