The Development and Applications of a Recombinant Fluorescent Fusion Protein-Based In Vitro Protease Assay Platform for Kinetic and Specificity Studies

Abstract

Munkánk célja egy rekombináns fehérje szubsztrátokra optimalizált Ni-NTA mágneses gyöngy-alapú fluoreszcens proteáz vizsgálati módszer kifejlesztése és alkalmazása volt. Az tervezett szubsztrátok tartalmaznak egy N-terminális hexahisztidin és egy maltóz-kötő fehérje fúziós címkét, a Dohány karcolatos vírus proteáz és a vizsgálni kívánt proteáz hasítási szekvenciáját, valamint egy C-terminális fluoreszcens fehérjét (FP). A mágneses gyöngyhöz immobilizált szubsztrátok alkalmazhatóságának igazolására enzimkinetikai, gátlási és pH optimum meghatározási vizsgálatokat végeztünk a dohány karcolatos vírus proteáz és 1-es típusú humán immundeficiencia vírus proteázokra. A mikrocső-alapú mérésekhez kidolgozott módszert mikrotiter lemezre is optimalizáltuk. A fluorimetriás mérések mellett kidolgoztunk egy eljárást, mellyel a redukáló körülmények között végzett SDS-poliakrilamid gél elektroforézist követően a denaturált FP-k a gélben renaturálhatóak, majd a fluoreszcencia alapján detektálhatóak. Célunk volt továbbá egy katalitikusan hatékonyabb venezuelai ló-láz encephalitis vírus 2-es számú nem-szerkezeti fehérje proteáz enzimforma létrehozása is. A kifejlesztett módszert alkalmazva vizsgálatuk a létrehozott enzimformák in vitro aktivitását és specificitását. A kifejlesztett vizsgálati módszer tovább optimalizálható nagy áteresztőképességű és automatizált mérésekhez, és alkalmazható proteáz szubsztrátok azonosítására, gátlószerek vizsgálatára, míg a specificitási vizsgálatok eredményei hozzájárulhatnak a további, alfavírusokat vagy egyéb IV. genetikai csoportba tartozó vírusokat célzó kutatásokhoz.

We presented the development and the utility of a Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay platform using recombinant protein substrates. The substrates consist of N-terminal His6 and maltose-binding protein fusion tags, a tobacco etch virus protease cleavage site sequence, the recognition site for the protease of interest and a C-terminal fluorescent protein. To test the on-bead application of the substrates, enzyme kinetic, inhibition, and pH optimum studies were performed on tobacco etch virus and human immunodeficiency virus type-1 PRs. Besides fluorimetric studies, substrates and products were assayed by PAGE, as well. We found that the denatured proteins could be renatured after reducing SDS-PAGE, and the fluorescent proteins were detected in the gel upon blue light and/or UV illumination. The platform was applied in a microplate-optimized format to characterize the in vitro activity and specificity of the purified venezuelan equine encephalitis virus non-structural protein 2 protease constructs. The developed assay platform can be adaptable to HTS and automation-based pharmaceutical protease substrate discovery, inhibitor screening and/or drug development, whereas the results of VEEV PR specificity studies could contribute to the investigation of alphaviruses or other important Group IV viruses.