Vizsgálataink célja melanomák BRAF inhibitorral (BRAFi, PLX4720: vemurafenib analóg) szemben létrejött rezisztencia hátterében álló molekuláris mechanizmusok részletes felderítése volt. Kísérleteink során BRAF inhibitor rezisztens primer és metasztázis eredetű melanoma sejvonalakat hoztunk létre és vizsgáltuk a sejtvonalak közötti molekuláris eltéréseket. ArrayCGH elemzéseink során új, a rezisztenciával összefüggésbe hozható kópiaszám eltéréseket találtunk az EXT1, SAMD12 és a REXO1L2P géneknél. Irodalmi adatok alapján az EXT1 gén ígéretes új célpont lehet egyes daganatok antraciklin terápiával szemben kialakuló rezisztencia leküzdésében. Megfigyeltük, hogy rezisztencia kialakulását követően egy sejtvonalnál BRAF-inhibitor “függőség” jött létre, ami teljes összhangban van mások megfigyelésével. Ezek szerint egyes BRAF- vagy MEK-inhibitorral szemben rezisztens melanomás betegek képesek ismét érzékennyé válni a gyógyszeres kezelésre, ami ígéretes terápiás lehetőséget jelenthet a kiválasztott betegek számára. Proteome Profiler Oncology Array vizsgálataink során megfigyeltük, hogy 84 daganat specifikus fehérje közül hat fehérje (ANGPLT4, EGFR, Endoglin, FGF2, Serpin E1, és VCAM-1) az összes rezisztens sejtvonalban növekedett expresszióval jellemezhető, ugyanakkor az OPN és a Survivin fehérjék expressziója csökken. Ezeknek a fehérjéknek a megváltozott expressziója egyértelműen arra utal, hogy a rezisztencia kialakulása több jelátviteli útvonalat érint, melyek megismerése további vizsgálatokat sürget a sikeres, több targetet célzó terápiák kidolgozásához. Párhuzamosan a BRAF inhibitorral szemben kialakult rezisztencia molekuláris hátterének feltárása mellett, vizsgáltuk egy nemrégiben szintetizált gyógyszer (HA15) hatását BRAFV600E mutáns melanoma sejteken. Az eredeti közlemény szerint a HA15 ER stresszt indukálva olyan hatásokat vált ki, melyek autofágián és apoptózison keresztül, jelentősen csökkentik a melanoma sejtek életképességét, ami független a melanoma sejtek mutációs státuszától és a rezisztencia kialakulásától. A publikált adatokkal ellentétben az in vivo állapotot közelítő sejttenyésztési körülmények között nem mutattunk ki szignifikáns melanoma sejtpusztulást HA15 kezelés során, csak azok a sejtek voltak érzékenyek a HA15-re, melyek előzőleg tápanyag megvonásban részesültek. Stressz és autofágia markerek kvantitatív analízise szerint a HA15 önmagában nem vált ki ER stresszt, de azt szinergikusan fokozza a tápanyag megvonással kezelt sejtekben. Ellentétben a közölt adatokkal HA15 rezisztens melanoma sejtvonalak is létrehozhatók. Összefoglalva, további vizsgálatokra van szükség annak bizonyítására, hogy a HA15 hatékony a melanoma ellenes gyógyszernek tekinthető.

To clarify the molecular background of BRAF inhibitor (BRAFi) resistance, we generated four drug-resistant melanoma cell lines from paired primary/metastatic cell lines using a vemurafenib analogue PLX4720. No such a comparison was reported before. By array CGH we detected new copy number alterations in all resistant cell lines (EXT1 and SAMD12 genes and REXO1L2P). Recently it was suggested that that EXT1 could be a promising novel target to overcome cancer cell stemness in anthracycline-based therapeutic resistance. In addition, we observed that beside the development of drug resistance, one melanoma cell line was able to develop BRAFi dependence. This is in a very good agreement with a recent report that some BRAF or MEK inhibitor-resistant melanoma patients may regain sensitivity to these drugs after a 'drug holiday'. This might create a promising therapeutic opportunity for selected patients. Using Proteome Profiler Oncology Array we detected the expression of 84 cancer-related proteins in BRAFi sensitive and resistant melanoma cell lines. We could identify distinct protein signatures associated with acquired BRAFi resistance. Increased expression of six proteins (ANGPLT4, EGFR, Endoglin, FGF2, Serpin E1, and VCAM-1) and decreased expression of two (OPN and Survivin) were consistently observed in all resistant cell lines. Downregulation of the OPN in association with acquired drug resistance was first observed by us. In parallel, we have investigated the effect a recently synthesized drug (HA15) that triggers endoplasmic reticulum (ER) stress and causes deleterious effects on melanoma cell viability due to autophagy and apoptosis, regardless of driver mutations or drug resistance. In contrast to the published data, we did not detect significant melanoma cell death under normal culture conditions using HA15 treatment. Indeed, only cells that were cultured under long-term starvation conditions were sensitive to the drug. Quantitative measurements of ER stress and autophagy markers showed that the compound HA15 does not trigger stress alone but synergistically enhances ER stress under starvation conditions. Importantly, we observed that the viability of normal melanocytes decreased significantly with treatment, even at low HA15 concentrations. Finally yet importantly, we were able to generate HA15-resistant cell lines, which failed by Cerezo et al. Taken together, HA15 only influences the viability of cells that are starved for several hours before and during treatment. In summary, further studies are needed to prove that HA15 is an effective anti-cancer agent.