Structural and Functional Characteristics of Transglutaminase 2 in Relation to Signal Transduction and Coeliac Disease

Absztrakt

Coeliac disease (GSE) is the most frequent, chronic small intestinal autoimmune disorder with broad spectrum of manifestation in genetically predisposed persons. The main autoantigen of GSE is the transglutaminase 2 (TG2). We identified that the specific TG2 autoantibodies also exist in small-bowel antibody deposits in seronegative patients. Our study confirms the hypothesis that the anti-TG2 autoantibodies are specific markers of GSE and are present in every coeliac patient. Our finding raises the possibilities that TG2 and anti-TG2 autoantibodies can play important role in pathogenesis of GSE. We found that immunoglobulins from patients with severe malabsorption enhanced the transglutaminase activity of TG2. This activating effect was dose-dependent, most pronounced with immobilised glutamine-acceptor substrates, and correlated inversely with the basal specific activity of the enzyme and with dietary treatment. A similar activation could be demonstrated also with the TG2-specific fraction of autoantibodies and in transamidation activity assays which use fibronectin-bound TG2 and thereby mimic in vivo conditions. These results suggest that coeliac antibodies may stabilise the enzyme in a catalytically advantageous conformation. GTPase activity of TG2 decreased in the presence of antibodies raising the possibility that inhibition of GTPase activity may affect cellular signalling. Since the TG2 could be a key player in GSE and the Ca2+-dependent function and structure relations were not completely characterised we examined the Ca2+-binding properties of TG2. We identified 5 non-canonical Ca2+-binding sites, out of which 3 by homology with known Ca2+-binding sites of TG3 and Factor XIIIa and the other 2 with negative surface potentials using site directed mutagenesis. CD spectroscopy, antibody binding assay and GTPase activity measurements indicated that the amino acid substitutions did not cause major structural alterations. 45Ca equilibrium dialysis and isothermal calorimetric titration showed that the wild type and active site deleted enzymes bind 6 Ca2+. Each mutant binds less Ca2+ than these and mutation of a site resulted in the loss of more than one Ca2+ ions. All mutants were deficient in transglutaminase activity and similarly to the wild type enzyme GTP inhibited remnant activities. Similarly to the wild type form GTPase activities of the mutants were sensitive to Ca2+-concentration except in case of S4 and S5 which exhibited increased GTPase activity. Testing reactivity of Ca2+ mutants with coeliac autoantibodies revealed that the S4 site strongly influenced antigenicity and the interaction of autoantibodies with TG2.

A coeliakia (GSE) a vékonybél leggyakoribb, genetikailag fogékony egyénekben kialakuló krónikus autoimmun betegsége, melynek igen sokféle klinikai manifesztációja lehet. A GSE fő autoantigénje az egyedülállóan sokarcú transzglutamináz 2 (TG2). Kimutattuk, hogy az anti-TG2 antitest lerakódások negatív szerológiai vizsgálatok esetén is jelen vannak a vékonybélben, megerősítve azt a hipotézist, hogy a betegekben mindig képződnek anti-TG2 autoantitestek. Ezért jogosan vetődik fel a lehetőség, hogy a TG2 és az anti-TG2 antitestek fontos szerepet játszanak a coeliakia patogenezisében illetve manifesztációjában. Munkánk alapján a súlyos felszívódási zavarral rendelkező betegek autoantitestei dózisfüggő módon fokozzák a TG2 transzglutamináz aktivitását. Hasonló aktiválás volt megfigyelhető egy in vivo körülményeket utánzó tesztben, ahol a fibronektinhez kötött TG2 transzglutamináz aktivitását vizsgáltuk specifikus TG2 ellenes autoantitestekkel. Eredményeink alapján valószínűsíthető, hogy a coeliakiás autoantitestek stabilizálják az enzimet a katalitikusan kedvező konformációban. Az autoantitestek gátolják az enzim GTPáz aktivitását, így befolyásolhatják a TG2 jelátviteli funkcióit is. A TG2 coeliakia patomechanizmusában lévő szerepének további tisztázásához megvizsgáltuk az enzim Ca2+-kötő sajátságait, mivel annak Ca2+-függő funkciója és az e mögött lévő szerkezeti tulajdonságok befolyásolhatják az autoantitestek kötődését a TG2-hoz. 45Ca equilibrium dialízis és izoterm mikrokalorimetriás titrálás azt mutatta, hogy a vad típus és a keresztkötő aktivitásra nem képes aktív hely mutáns egyaránt 6 Ca2+-t köt. Homológ modellezés, negatív felületi potenciálú helyek kiválasztása és irányított mutagenezis segítségével azonosítottunk 5 különböző Ca2+-kötő (S1-S5) helyet, melyek szerkezetileg nem kanonikus Ca2+-kötő helyek és multiplex kötésre is képesek lehetnek. Minden ezeket érintő mutáns Ca2+-kötő képessége csökkent, annak ellenére, hogy CD spektroszkópia, antitest kötési vizsgálat és GTPáz mérés alapján elmondhatjuk, hogy ezek a mutációk nem okoztak szignifikáns szerkezeti változást. Egy kötőhely mutációja egynél többel csökkentette a kötött Ca2+-ok számát, ami a kötőhelyek közötti kooperativitásra utal. Az S1 hely nagy affinitású kötőhely, a többi alacsony affinitással köti a Ca2+-t. Minden mutánsnak csökkent a transzglutamináz aktivitása, ami GTP-vel gátolható volt. A vad típushoz hasonlóan a GTPáz aktivitások Ca2+-függőek voltak kivéve az S4 és S5 mutánsokat, amelyeknek jelentősen emelkedett a GTPáz aktivitása. Az S4 hely jelentősen befolyásolja a TG2 antigenitását, azaz szerkezeti kapcsolatban van a TG2 coeliakiában fontos epitópjaival és ez az új ismeret lehetőséget ad azok pontosabb lokalizálására.

Leírás
Kulcsszavak
transglutaminase 2, transzglutamináz 2, transglutaminase activity, transzglutamináz aktivitás, calcium-binding, kalcium-kötés, coeliac disease, coeliakia, antibody enhancing, antitest erősítés, GTPase activity, GTPáz aktivitás, antigenicity, antigenitás, coeliac epitope, coeliakia epitóp, dermatitis herpetiformis
Forrás