Although the higher-order structure of eukaryotic chromosomes has been the focus of considerable attention, little is known about the signals that mark the boundaries of interphase chromatin loops. The chromatin fragmentation phenomenon described herein seems particularly important because (a) it reflects regularities in the organization of higher order chromatin structure, (b) it appears to be interrelated with questions concerning genome instability, apoptosis and chemotherapy-associated gene rearrangements. Applying biophysical and molecular biological techniques (e.g. CLSM, LSC, flow cytometry, halo-FISH, FIGE-SSGE, ChIP), we have visualized the global disassembly of the chromatin of healthy, non-apoptotic human cells into particles apparently containing the DNA-loops, for the first time. Data we have obtained provide evidence for the existence of preformed single-strand discontinuities all over the entire genome, which appear to be arranged on the two DNA strands in an alternating, staggered fashion, positioned at loop-size intervals. The chemical nature of the DNA-termini have been characterized by in situ nick labeling, revealing uniform ends with 3’OH groups, tightly protected by structures sensitive to ribonucleolytic treatments. Our results suggest an association between the nicks present at the bases of chromatin loops and the nuclear matrix attached architectural hnRNA-network. To study the role of particular DNA regions in the observed phenomena, we extended our studies on the breakpoint cluster region (bcr) of the Mixed Lineage Leukemia (MLL) gene that is frequently rearranged in childhood and posttherapeutic leukemias. The sequence specificity of nick accumulation, the possible function of nick froming sequence motives as well as the role of topoisomerase II have been investigated by linear primer extension footprinting and chromatin immunoprecipitation (ChIP). The results demonstrate the involvement of the above enzyme in the generation / maintenance of nicks at non-random positions. As studied by halo-FISH and ChIP, the disintegration of the chromatin at MLL bcr was dependent on local epigenetic and broader chromosomal context, with marked differences between germline and rearranged MLL. The high level of H3K-acetylation and H3K4-methylation at gMLL indicates transcriptionally active, relaxed chromatin structure, suggesting that the incidence of ss-breaks is highly dependent on chromosomal context. We hypothesize that the ss discontinuities present at every ~50 kbp throughout the genome might explain the frequent involvement of loop anchorage sites in chromosomal translocations. In view of the special significance of epigenetic context in the incidence of nicks - probably predisposing for pathological gene rearrangements, we have also developed a novel high-throughput screening method for the evaluation of ChIP results, applicable in a clinical set-up, combining biophysical and molecular biological know-how.

A genom szerveződésében van egy általános alapelv: az örökítőanyag egy limitált térfogatot foglal el, s hossza sokszorosan felülmúlná az őt tartalmazó kompartment dimenzióit, ha nem szerveződne ún. magasabbrendű struktúrákba. Mai tudásunk szerint a magasabbrendű kromatin szerkezet alapja a DNS molekula hurkos-doménekbe történő szerveződése, amely a magstruktúra enigmatikus „nukleáris mátrix” koncepciójával hozható összefüggésbe. A 30-150 kbp méretű DNS régiókat formáló hurkok a kromatin szerkezeti hierarchiájának azon szintjét alkotják, melynek fontos, ám teljességgel feltáratlan funkcionális relevanciája lehet. A hurkok kihorgonyzási pontjai (angolul scaffold//matrix attachment regions, S/MARs) gyakran promoterek, replikációs origók, rekombinácós forró pontok közelében találhatóak, s egyre valószínűbb, hogy alapvető szerepet játszanak különféle patológiás gén-átrendeződésekhez / kromoszóma aberrációkhoz vezető folyamatokban. A S/MAR szekvenciák meglepő sajátsága a nagyfokú heterogenitásuk és a konszenzus szekvenciák hiánya; egyedüli kivétel a topoizomeráz II enzim konszenzus szekvenciája, amely az eddig megszekvenált S/MAR-ok 85%-ában jelen van. A kromatin hurkok közvetlenül megfigyelhetők az un. halo-kísérletek során, és kromatin fragmentációs jelenségek kapcsán. Előbbi esetben sejteket nagy ionerősségű sóoldattal extrahálva ún. halo-preparátumot nyerhetünk, amelyben a sejtmag mátrixhoz rögzülő, illetve abból kibomló kromatin hurkok tömegét figyelhetjük meg. A kromatin hurok-méretű darabokra történő fragmentálódása (hurok-méretű DNS fragmentáció) megfigyelhető mind apoptotikus sejtek, mind normál sejtek esetében - intenzív proteolitikus körülmények között: az ionos detergens és proteáz, valamint kelátor jelenlétében izolált DNS ~50 kbp-os átlagos méretű, szemben az agaróz-blokkban lizált sejtekből származó DNS megabázisos méretével, amely feltehetően a hurkok rögzítési pontjainál történő törés/hasadás eredménye. Az akut és poszt-terápiás leukémiák nagy részében a Mixed Lineage Leukemia (MLL) gén mintegy 40 partnergén valamelyikével transzlokálódik. Az MLL töréspont klaszter régiója (breakpoint cluster régiója, bcr) az 5. és 11. exonok közötti 8.3 kb-os szakaszt öleli fel. De novo leukémiákban az MLL BCR az 5.exon és a 8.intron első harmada közötti területen törik leggyakrabban, míg poszt-terápiás leukémiákban a 8. intron második harmada és a 11.exon közötti szakaszon, ezen belül leggyakrabban egy topoizomeráz II konszenzus szekvencia környezetében, a 9. exonban. A bcr a mi szempontunkból az 50 kbp-os fragmentáció töréspontjainak egy reprezentánsa, mely azért is érdekes, mert a leukemogenezis egy sajátos, kísérleti stratégiánk szempontjából lényeges modellje épül arra a tényre, hogy az MLL bcr apoptózisban is tapasztalt preferenciális hasadását olyan kimérikus transzkriptumok megjelenése is követte, melyek kromoszóma transzlokáció bekövetkezésére utaltak. Munkánk során a teljes kromatin állományon illetve az MLL bcr-en, mint modell rendszeren azt az izgalmas hipotézist vizsgáltuk, amely szerint a hurok-méretű kromatin fragmentációban érintett fragilis helyek egyben a kromoszóma rendellenességek, transzlokációk predilekciós helyei.