Tőzsér, JózsefZahuczky, Gábor József2007-06-212007-06-2120032007-06-21http://hdl.handle.net/2437/2464A doktori értekezésemben felhasznált munkáim során alkalmam volt a retrovirális proteinázok HTLV-BLV csoportjába tartozó proteinázok fő képviselőinek (HTLV-I, BLV PR) előállítására, specificitásuknak egymással, illetve a HTLV-I PR specificitásának a HIV-1 PR-al történő összehasonlítására. Lehetőségem volt még a ciszteinil proteinázok egyik élettani szempontból igen fontos szereppel bíró családjának, a kaszpázoknak három képviselőjével kísérleteket végezni a szubsztrát-foszforiláció és a hasíthatóság összefüggéseinek a vizsgálatára, valamint mutáns kaszpáz-3 enzimek előállítására. Vizsgálataink a két enzimcsalád enzim-szubsztrát kölcsönhatásainak alapos megismerését szolgálták, miközben általános összefüggések felismerésére törekedtünk. BLV PR előállítása érdekében a proteináz cDNS-t fúziós vektorba (pMal-c2) klónoztuk, amelyből expresszáltattuk és tisztítottuk. A tisztítás során kiderült, hogy az enzim képes saját aktív formájának a kialakítására, az előállítását szolgáló konstrukcióból önmaga kihasítására, mind N- és C-terminális irányból. Sikerült az enzimet inklúziós testekből kinyernünk, majd kationcserés és gélszűréses módszerrel homogénre tisztítanunk. Tárolás során további részleges önprocesszálást tapasztaltunk, ami azonban nem járt szignifikáns aktivitáscsökkenéssel. A HTLV-I és BLV proteinázok specificitás-összehasonlítása alapján arra következtethetünk, hogy a BLV PR szélesebb specificitással rendelkezik mint a HTLV-I PR, de a specificitásbeli különbség közöttük – a szubsztrátkötő régiót alkotó részben található homológiával arányosan - nagyobb, mint ami a HIV-1 és HIV-2 PR között tapasztalható. A HTLV-I proteinázok specificitásvizsgálatait a már számos egyéb retrovíruscsalád reprezentatív képviselőjének jellemzésére is felhasznált HIV-1 MA/CA peptidsorozattal kívántuk elvégezni, de a vizsgálatok során kiderült, hogy a HTLV-BLV csoport képviselőinek a többi retrovirális proteinázétól való eltérő szubsztrátspecificitása miatt más sorozatot kell választanunk. A HTLV-I és a HIV-1 proteinázok közötti különbségek részleteit az alzsebek vonatkozásaiban a HTLV-I CA/NC peptidsorozattal tártuk fel. A vizsgálataink azt mutatták, hogy a HIV-1 proteinázoktól eltérően az S4 és S2 zsebek esetében döntően a hidrofób jellegű kölcsönhatások a meghatározóak, míg az S3, S1 és S1’ zsebek specificitásában nagyobb a hasonlóság. A HIV-1 MA/CA hasítási helyhez hasonlóan úgy tűnik, hogy a HTLV-I CA/NC hasítási hely is evolúciósan az újonnan szintetizálódó poliproteinek gyors hasítására szelektálódott ki, mivel a szubsztituált szubsztrátok nagy része lényegesen lassabban hasadt mint a szubsztituálatlan analógok. A kaszpáz specificitásvizsgálatainkat konkrét kérdéskörre szűkítettük, mivel az általános specificitásvizsgálatokat már korábban elkészítették. Ez a kérdéskör a foszforiláció volt, amely egy teljesen általános szabályozási mechanizmus. A foszforiláció proteolízisre kifejtett hatásának tanulmányozása a foszforilált aminosavak közvetlen szerepének feltárásával ritka az irodalomban. Számos esetben a foszfo-Ser mimikálása érdekében helyspecifikus mutagenezissel lecserélik a Ser oldalláncot aszpartátra és így próbálnak meg funkcionális következtetéseket levonni. Vizsgálataink bebizonyították, hogy legalábbis a kaszpázspecificitás tekintetében az Asp és a foszfo-Ser semmiképpen sem tekinthető ekvivalensnek: míg a kaszpáz-3, -7, -8 enzimek számára az Asp eszenciális a P1 pozícióban, és a P4 pozícióban is erősen preferált a kaszpáz-3 és -7 enzimek számára, a foszfo-Ser ugyanezen poziciókban erősen csökkentette vagy teljesen meggátolta a hasíthatóságot. Ebből adódóan a P1’ és P4 Ser oldalláncok foszforilációjának szabályozó szerepe lehet a fehérjék kaszpáz mediált lebontásában.52 p450079 bytes384601 bytes1981689 bytesapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfhuA kéziratos PhD dolgozatok csak a szerzői jogok maradéktalan tiszteletben tartásával használhatókElméleti orvostudományokOrvostudományok