Guttman, AndrásSárközy, Dániel2024-11-212024-11-212024https://hdl.handle.net/2437/382466A műszeres analitikai technikák rutinszerű alkalmazása az utóbbi években alapvető jelentőségűvé vált, amit a jelen biotechnológiai, élelmiszeripari és orvosi kutatások számának ugrásszerű növekedése, valamint a piacon megjelenő új gyógyszer hatóanyagokkal, élelmiszer összetevőkkel szemben támasztott szigorú minőségbiztosítási előírások megjelenése indokol, melyek új kihívások elé állították az analitikai és molekuláris biológiai tudományterületek képviselőit. Az újgenerációs biológiai készítményekre (akár nagy molekulájú terápiás antitestekről, akár kisebb molekulaméretű gyógyszerkészítményekről és étrend-kiegészítő komponensekről beszélünk) egy természetes szerkezeti változatosság jellemzi, mely által a termékek bizonyos fokú heterogenitást mutatnak. Ezen változatok karakterizálásának, illetve biztonságos alkalmazhatóságának és hatásosságának elérése érdekében felmerült az igény, hogy a vizsgált analitikai problémák megoldására a már ismert és elfogadott standard megközelítések mellett ortogonálisan alkalmazható módszerek szülessenek, valamint, hogy azok folyamatos fejlesztési és optimalizálási lépesekkel a mindennapi analitikai gyakorlatba beépíthetők legyenek. Az elérhető, analitikai tudományterületen íródott tananyagok és tudományos publikációk alapján ismeretes, hogy létezik egy olyan egyszerű, gyors és nagyfelbontású műszeres technika, mely kis mintaigényével, valamint páratlan hatékonyságával egyre nagyobb jelentőséggel bír az elválasztástechnika területén, megcélozva főként az ipari (pl. gyógyszer tisztaság vizsgálatok) és orvosdiagnosztikai (pl. biomarker azonosítás) feladatok ellátását, továbbá a klasszikus HPLC-alapú módszerek által nem, vagy csak nehezen megoldható analitikai problémák alternatív áthidalását. Ez a technika a kapilláris elektroforézis (CE), aminek előnyös tulajdonságait és biológiai molekulák analízisére történő alkalmazhatóságát számos kérdés övezi. Doktori munkám során ezért kitűzött célom volt, hogy a ma ismert, legnagyobb jelentőséggel bíró kapilláris gélelektroforetikus (CGE) módszereknek a biomolekulák két nagyobb csoportján (fehérjéken és oligoszacharidokon) történő alkalmazhatóságát bemutassam, valamint, hogy ismertessem azon alapvető módszerfejlesztési kritériumokat, melyek segítségével megválaszolhatók a vizsgált biológiai mintákat és azok CGE analízisét érintő reprodukálhatósággal és hatékonysággal kapcsolatos kérdések. Ezek mellett fontosnak tartom bemutatni azokat az elektroforetikus elválasztó közegeket, melyeket a kutatómunkám során vizsgált mintákra optimalizálva fejlesztettem ki, ugyanis ezek tették lehetővé számomra a különböző mintatípusok szerinti hatékonyabb analízist. Bizonyos fehérjék és szénhidrátok CGE technika általi vizsgálatához azonban nem csupán a megfelelő elválasztási alapelv és elválasztó közeg megtalálása szükséges, legalább ekkora relevanciával bír egy érzékeny detektálási mód kiválasztása is. A megfelelő detektor optimális esetben jól definiálható képet ad a vizsgálandó analitokról, melynek révén lehetővé teszi azok pontos kvalitatív és/vagy kvantitatív meghatározását. A klasszikus, ultraibolya abszorbancia (UV) alapú detektálási módszerek mellet napjainkban előnyt élveznek az indirekt elven működő (pl. fluoreszcencia alapú) detektálási módszerek, melyek derivatizált minták nagy érzékenységű észlelését és karakterizálását teszik lehetővé. Dolgozatomban ezért bizonyos jelölési reakción alapuló detektálási lehetőségekre is kitérek, valamint azon kapcsolt technikákat is érintem, melyek direkt módon valósítanak meg ugyancsak nagy érzékenységű és nagy felbontású strukturális információgyűjtést. Ezek közül az elektrospray ionizációs tömegspektrometriát (ESI-MS) ismertetem részletesebben, melyet a mai analitikai gyakorlatban általában a standardként elfogadott kromatográfiás kapcsolhatósága, valamint kis, és nagymolekulák pontos szerkezetazonosítási képességével jellemeznek. Az általam tanulmányozott koncepció ettől eltérően az ESI-MS technika CGE-vel való bonyolult, ám annál nagyobb potenciállal bíró összekapcsolásának lehetősége, melynek alkalmazhatósága elsődlegesen az elválasztó közegek összetevőinek függvényében változik. Ennek tudatában megfogalmazott célként egy a biotechnológiai ipar számára évek óta fennálló analitikai probléma (fehérjék méret szerinti elválasztását követő, ”on-line” szerkezetazonosítás) megoldását is kitűztem. Az új megközelítés lényege, hogy a klasszikus nátrium dodecilszulfát poliakrilamid lapgélelektroforézis (SDS-PAGE) technika analógjaként alkalmazható, gyorsabb és on-line detektálást lehetővé tévő SDS-kapilláris gélelektroforézist (SDS-CGE) tömegspektrometriás detektálással kapcsolva optimalizáljam, ezzel megalkotva egy olyan analitikai rendszer kombinációt, mellyel a fehérjék méret alapú elválasztását tömegspektrometria általi, egyértelmű strukturális azonosítás követheti. A fejlesztett elválasztó közegeket, módszereket és detektálási módokat munkám során elsődlegesen újgenerációs, fehérje alapú bioterapeutikumokon, valamint N-kötött és szabad (nem fehérjéhez kötött) oligoszacharidok karakterizálásán keresztül szemléltetem.The routine application of analytical techniques has become fundamentally important in recent years. This shift is driven by the exponential increase in current biotechnological, food industry, and medical research projects, along with the emergence of strict quality assurance regulations for new active drug ingredients and food components. These developments have posed new challenges for representatives of analytical and molecular biology fields. Next-generation biological products - whether considering large-molecule therapeutic antibodies or small-molecule pharmaceuticals and dietary supplements - exhibit natural structural variability, leading to a certain degree of heterogeneity in these products. To characterize these variants and ensure their safe and effective use, there has been a demand for the development of orthogonally applicable analytical methods in addition to the known and accepted standard approaches. Moreover, continuous development and optimization steps are required to integrate these methods into everyday analytical practice. Based on the available educational materials and scientific publications in the analytical field, it is known that there is a simple, rapid, and high-resolution technique orthogonal to the standard chromatography-based approaches. With its low sample requirement and unparalleled efficiency, this technique is gaining increasing significance in the field of separation science. It is particularly targeted towards industrial applications (e.g., pharmaceutical purity testing) and medical diagnostics (e.g., biomarker identification), as well as providing alternative solutions to analytical problems that classical HPLC-based methods cannot address or can only address with difficulties. This technique is capillary electrophoresis (CE), surrounded by many questions regarding its advantageous properties and applicability for the analysis of biological molecules. During this doctoral research, my goal was to demonstrate the applicability oftoday’s most significant capillary gel electrophoresis (CGE) methods for two major groups of biomolecules: proteins and oligosaccharides. Additionally, I aimed to outline the fundamental method development criteria that address questions related to the reproducibility and efficiency of CGE analysis of the examined biological samples. I also consider it important topresent the developed electrophoretic separation media optimized for the analytes studied inmy research, as these enabled more efficient analysis for different types of samples. To investigate certain proteins and carbohydrates using the CGE technique, it is not only necessary to find the appropriate separation principle and buffer systems, but also to select a sensitive detection method. A sufficient detector, in an optimal case, provides a well-defined image of the analytes, enabling their accurate qualitative and/or quantitative determination. Besides the classic ultraviolet absorbance (UV) detection methods, indirect detection methods (e.g., fluorescence-based approaches) have gained preference in recent times, allowing for the highly sensitive detection and characterization of derivatized samples. In my dissertation, I also address detection possibilities based on certain labeling reactions, as well as coupled techniques that provide high-sensitivity and high-resolution structural information directly. Among these, I detail electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) technique, which is commonly used in modern analytical practice for its standard chromatographic connectivity and precise structural identification capabilities for both small and large molecules. In contrast, the concept I have studied explores the complex yet highly promising coupling of the ESI-MS technique with CGE. The applicability of this combination primarily depends on the composition of the separation media. With this understanding, I aimed to address a long-standing analytical challenge in the biotechnology industry: the "on-line" size-based capillary gel electrophoretic separation of proteins followed by the structural identification via mass spectrometry. The essence of this new approach is to optimize SDS-capillary gel electrophoresis (SDS-CGE) coupled with MS detection, analogous to the classical sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) technique, but allowing for faster and on-line detection with accurate mass-to-charge ratio information on the molecules of interest. The separation media, methods, and detection modes developed during my work were primarily examined through the characterization of new-generation, protein-based biotherapeutics, as well as N-linked and free (non-protein-bound) oligosaccharides.131 oldalhukapilláris elektroforézis (capillary electrophoresis)tömegspektrometria (mass spectrometry)terápiás fehérjék (therapeutic proteins)N-glikánok (N-glycans)szabad oligoszacharidok (free oligosaccharides)analitikai módszerfejlesztés (analytical method development)Elméleti orvostudományokOrvostudományok