Sipiczki, MátyásBalázs, Anita2012-02-282012-02-282012http://hdl.handle.net/2437/123463A Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus (a továbbiakban Sch. japonicus) egy a Schizosaccharomycetales-rendbe tartozó egysejtű hasadóélesztő, melynek CBS 354 elnevezésű törzsét eperből erjesztett borból izolálták [Yukava és Maki, 1931]. A rokon fajhoz, a klasszikus és molekuláris genetika kedvelt modellszervezetéhez, a Sch. pombe-hez hasonlóan haploid genetikai állománnyal rendelkezik, amely lehetővé teszi, hogy a recesszív mutációk fenotípusosan is megnyílvánuljanak. A Sch. japonicus életciklusára, szemben az Sch. pombe egysejtű haploid életmenetével, a dimorfizmus jellemző: a fiatal telepek egyedi sejtjei szilárd táptalajon 8-10 nap elteltével többsejtű hifát fejlesztenek [Sipiczki és mtsai, 1998]. A Sch. japonicus ugyan nem patogén, de mivel egyes patogén fajokban, mint például a növényi Ustilago maydis-ban [Bölker, 2001], humán patogénekben, például a Candida albicans-ban [Gow & Gooday, 1987] és a Histoplasma capsulatum-ban [Eisenberg és mtsai, 1996] a dimorfizmus virulenciafaktorként szerepel, a Sch. japonicus vizsgálata hozzásegíthet a dimorf gombák virulenciájának megértéséhez, azon keresztül új gombaellenes terápiák kidolgozásához. Mindezek miatt a Sch. japonicus nemrégiben ígéretes modellorganizmussá vált [pl. Rhind és mtsai, 2011]. A genomszekvenciája teljes mértékben elérhető vált [Broad Institute internetes honlapján], amely lehetővé tette génjeinek klónozását és szerepük vizsgálatát. A Debreceni Egyetem Genetikai és Alkalmazott Mikrobiológiai Tanszékén hagyománya van az élesztő sejtciklus kutatásának. A sejtciklus utolsó lépése a sejtszeparáció és citokinézis, ennek tanulmányozásába kapcsolódtam bele. A Sch. pombe citokinézise során először egy szeptum képződik, később az osztódással létrejött leánysejtek elválnak az elsődleges szeptum feloldásával. Az érett szeptum egy három lemezből álló struktúra, amely egy belső elsődleges és az azt két oldalról határoló másodlagos szeptumokból épül fel [Johnson és mtsai, 1973]. Az Sch. pombe sejtszeparációban részt vevő génjeinek funkciója alaposan tanulmányozott tudományterület. Ezek a gének egy regulációs útvonalon találhatóak. A folyamat két fő transzkripciós faktora a Sep1p és Ace2p fehérjék [Sipiczki és mtsai, 1993; Martin-Cuadrado és mtsai, 2003]. A sep1+ az elsőként leírt sejt-szeparációs gén [Sipiczki és mtsai, 1993], amely azonban a sejtszeparáción kivül egyéb folyamatokban is szerepet játszik [Rustici és mtsai, 2004]. A Sep1p egy fork-head típúsú DNS kötő domént tartalmaz. A sep1+ mRNS szintje nem mutat periodicitást a sejtciklus alatt [Zilahi és mtsai, 2000], tehát a gén aktivitása valószínűleg poszt-transzkripciósan szabályozódik. A sep1 sejtek nem képesek elválni egymástól, hifás növekedést mutatnak [Sipiczki és mtsai, 1993]. Az ace2- sejtek szintén hifás növekedést mutatnak a sep1 mutánshoz hasonlóan, és az ace2+ túltermelés elnyomja a sep1 fenotípust [Martin-Cuadrado és mtsai, 2003], tehát a Sep1p az ace2+ génen keresztül szabályoz. Az ace2+ egy cink-ujj transzkripciós faktort kódol [Martin-Cuadrado és mtsai, 2003], ami foszforilációval poszttranszlációsan szabályozódik, és valószínűleg a Cdc2p ciklin dependens kináz, sejtciklus fehérje is regulálja ily módon [Petit és mtsai, 2005]. A Sep1p-Ace2p transzkripciós szabályozók több célgénnel is rendelkeznek. Az eng1+ gén terméke egy beta 1,3 endoglukonáz, ami az elsődleges szeptum elbontásában szerepel; az agn1+ által kódolt fehérje, az Agn1p, ami egy alfa 1,3 glukanáz, pedig a szeptum szélénél levő, a még szét nem vált sejtek sejtfalának hidrolízisében vesz részt [Martin-Cuadrado és mtsai, 2003; Dekker és mtsai, 2004; Garcia és mtsai, 2005]. A mid2+ gén által biztosított Mid2p protein szerepe az ún. szeptin gyűrű létrehozásában van, amely segíti az Agn1p és Eng1p enzimek exocitózisát [Berlin és mtsai, 2003; Tasto és mtsai, 2003]. A Sch. pombe Sep1p, Ace2p, Agn1p, Eng1p, Mid2p fehérjékhez nagyon hasonló szekvenciájú fehérjéket kódoló gének megtalálhatóak a Sch. japonicus genomjában, melyek szerepe munkánk kezdetekor még nem volt ismert ebben a fajban. Megismerésük fontos lehet, mert a Sch. japonicus fonalas növekedésre is képes, és ebben a morfológiai formában látszólag feleslegessé válnak ezek a gének, vizsgálatuk tehát új információkat szolgáltathat a dimorfizmus szabályozásáról. Ezek alapján a következő célokat tűztük ki: 1. Az említett génekben mutáns Sch. japonicus törzsek létrehozása és a mutáns fenotípusok vizsgálata. 2. A sejtszeparációs mutánsok hifaképzésének és hifa darabolódásának tanulmányozása (az érintett gének szerepe az élesztős és fonalas fázisok közötti átváltásban). 3 Megvizsgálni, hogy a Sch. japonicus sejtszeparációs fehérjéi képesek-e a nagy hasonlóságú génekben mutáns Sch. pombe törzsek fenotípusát komplementálni (funkcionális homológia vizsgálata). 4. A Sch. japonicus sejtszeparációs gének funkció vizsgálata fajon belül: a. A sep1Sj, ace2Sj inaktiválásának vizsgálata más sejtszeparációs gének működésére. b. A Sch. japonicus Eng1pSj, Agn1pSj, Mid2pSj fehérje GFP jelölése és sejten belüli lokalizálása. Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus (later Sch. japonicus) is a fission yeast, which belongs to the Schizosaccharomycetales order, and its CBS 354 strain was isolated from strawberry wine [Yukava and Maki, 1931]. It has haploid genetic material, as the related, in the classical and molecular genetics preferred Sch. pombe, which allows the manifestation of the recessive mutations phenotypically. In contrast to Sch. pombe, the life cycle of Sch. japonicus is dimorphic, which means that it can switch from unicellular yeast-type to multicellular hyphal growth after 8-10 days of incubation on solid medium [Sipiczki et al, 1998]. Sch. japonicus is not pathogenic, although in some species, for example in Ustilago maydis (plant patogen) [Bölker, 2001], Candida albicans and Histoplasma capsulatum (human pathogens) the dimorphism is a virulence factor [Eisenberg et al, 1996; Gow & Gooday 1987]. In spite of not being a virulence factor, the investigation of the Sch. japonicus dimorphism could help us better understand the mechanism of virulence of the pathogenic dimorphic fungi, which then may enable medical mycologists to find new anti-fungal therapies. Largely due to these features, it recently became a promising model organism in molecular biology [Rhind et al, 2011]. Its genome was completely sequenced (the genome sequence is available on the webpage of Broad Institute). The availability of its genome sequence allows cloning and examining of its genes. In the Department of Genetics and Applied Microbiology at the University of Debrecen there is a tradition of the research of the yeast cell cycle. The last step of the cell cycle is the cytokinesis. I joined the investigation of this topic. During the cytokinesis in the Sch. pombe cell, a septum is made first then the daughter cells separate by the breakdown of the primary septum. The mature septum has a three layered structure composed of the inner primary septum and the flanking secondary septa.[Johnson at al, 1973]. The genes and the encoded proteins which take part in the cell separation of Sch. pombe and their regulation have been examined intensively and are known in details. In this process the proteins act in a cascade which has two main transcription factors: Sep1p and Ace2p [Sipiczki et al, 1993; Martin-Cuadrado et al, 2003]. The first described cell separation gene was sep1+ [Sipiczki et al, 1993]. It encodes a transcription factor which plays role in other processes as well [Rustici et al, 2004]. The Sep1p protein contains a fork-head-type DNA binding domain and its transcipt level shows no periodicity during the cell cycle, so it might be regulated by a post-transcriptional mechanism [Zilahi et al, 2000]. The sep1- cells are unable to separate from each other, and thus show hyphal-like growth [Sipiczki et al, 1993]. The ace2- cells form hyphae indistinguishable from those of sep1- and the overexpression of ace2+ rescues the sep1- phenotype [Martin-Cuadrado et al, 2003], indicating that the Sep1p protein controls cell separation through ace2+. The ace2+ gene encodes a zinc-finger transcription factor [Martin-Cuadrado et al, 2003]. Ace2p is posttranslationally modified by phosphorylation and Cdc2p cell cycle protein might have a role in its regulation [Petit et al, 2005]. The Sep1p-Ace2p transcription factors target many genes, among others those which encode proteins for septum cleavage (Eng1p, Agn1p) and Mid2p. The eng1+ gene encodes an endo-beta-1,3 glucanase which degrades the primary septum. The agn1+ gene encodes an 1,3-alfa-glucanase which takes part in the erosion of the cell wall around the edge of the primary septum [Martin-Cuadrado et al, 2003; Dekker et al, 2004; Garcia et al, 2005]. The Mid2p protein, also regulated by Ace2p, is an anillin homologue, which helps the exocitosis of Agn1p and Eng1p by organizing the assemby of the septin ring [Berlin et al, 2003; Tasto et al, 2003]. The genes encoding the homologous proteins of the above mentioned Sep1p, Ace2p, Agn1p, Eng1p, Mid2p are present in the genome sequence of Sch. japonicus but their roles were not known yet at the time of launching this project. As Sch. japonicus is a dimorphic organism, it would be also important to know more about the regulation of the activity of these cell separation genes during the transitions between the yeast and hyphal growth phases. Based on these considerations we carried out the following research: 1. The characterisation of the above-mentioned genes and proteins in Sch. japonicus: creating mutant strains defective in these genes and investigation of their phenotypes. 2. Examination of the hypha formation, and fragmentation in the mutant strains (the roles of the genes in the switching between yeast and hypha phases). 3. Comparing the functions of these homologous proteins in the two species by testing if the proteins produced by the Sch. japonicus genes can complement the Sch. pombe deletion mutations (examination of functional homology). 4. Investigation of the function of Sch. japonicus cell separation genes: a Effect of the inactivation of sep1Sj, ace2Sj genes on function of other cell separation genes. b Expressing GFP (green fluorescens protein) tagged Sch. japonicus proteins (Agn1pSj, Eng1pSj, Mid2pSj) and localizing them within the cell.129huSchizosaccharomyces japonicusdimorfizmussejtszeparációhyphahasadó élesztődimorphismcell separationfission yeastTermészettudományok