Vereb, GyörgySzöőr, ÁrpádMezősi-Csaplár, Marianna2024-02-092024-02-092024https://hdl.handle.net/2437/366191A kiméra antigén receptorokkal (CAR) módosított T sejtek paradigmaváltást hoztak a kemoterápia-rezisztens limfómák kezelésében, szolid szervi daganatokkal szemben alkalmazva azonban hatékonyságuk elmaradt a várakozástól. Bár a CAR konstrukciók CD3z effektor alegysége mellé beépített CD28 vagy 41BB kostimulációs domének nagy mértékben fokozták a T sejt készítmények hosszú távú hatékonyságát, a korai tumorellenes aktivitásban betöltött szerepük egyelőre tisztázatlan. Munkánk első felében első (.z), második (CD28.z, 41BB.z) és harmadik (CD28.41BB.z) generációs CAR-ok alkalmazásával tanulmányoztuk a CD28 és 41BB kostimulációs domének hatását a CAR-ok sejtfelszíni szerveződésére, diffúziós kinetikájára, és a korai citolitikus jelátvitel hatékonyságára. Eredményeink szerint míg a .z és a CD28.z CAR-ok dimereket képeznek, és azok nagy kiterjedésű membrán klasztereket alkotnak, a 41BB t tartalmazó CAR-ok főleg oligomer formában vannak jelen, és kisméretű membrán klaszterekbe szerveződnek. A CAR-ok laterális diffúziós sebessége a CD3z domén membrán síkjától mért távolságával arányos növekedést mutatott. Az első tumorsejttel való találkozáskor mind a CD28.41BB.z rendkívül mobilis oligomerjei és azok kisméretű klaszterei, mind a .z CAR-ok előre összeszerelődött nagyméretű klaszterei hatékonyabb proximális jelátvitelt közvetítettek, mint a közepesen mobilis CD28.z és 41BB.z CAR-ok. Ugyanakkor egy napos távon a tumorellenes citolitikus aktivitás a CD28.41BB.z CAR esetén bizonyult a legalacsonyabbnak, míg a .z CAR T sejtek tumor eliminációs hatékonysága minden vizsgált konstrukció között a legjobb volt. Mindezek alapján a molekuláris szerkezet, a membránbeli szerveződés és a mobilitás kritikus paraméterei az optimális terápiás hatékonysággal rendelkező CAR-ok tervezésének a kostimulációs domének hosszú távú biológiai hatása mellett. Munkánk második felében a CAR T sejtek hosszú távú hatékonyságát vizsgáltuk, melyben igen jelentős szerepet játszik a sejttermék összetétele. A hematológiai megbetegedéseket célzó CAR T terápiák esetén megfigyelték, hogy a kevésbé differenciálódott, citotoxikus CD8+ T sejtben gazdag készítmények rendelkeznek a legkedvezőbb tumorellenes hatékonysággal. Eredményeink szerint azonban szolid tumor modellekben a jobban differenciált, effektor memória domináns CAR T sejttermékek erősebb in vitro citotoxicitással rendelkeznek és kevésbé merülnek ki hosszan tartó antigénstimuláció alatt, mint azok a sejtcsoportok, amelyek differenciációját az előállítási szakaszban korlátoztuk. Megfigyeltük továbbá, hogy a 41BB kostimuláció hatására, valamint a transzdukciót megelőző T sejt expanzió során alkalmazott RetroNectin stimuláció mellékhatásaként a CD8+ citotoxikus CAR T sejtek aránya jelentős növekedést mutatott. Preklinikai modellünkben demonstráltuk, hogy az effektor memória irányú differenciáció, és a kiegyensúlyozott CD4+/CD8+ arány kölcsönzi a legerőteljesebb expanziós és citolitikus hatékonyságot a HER2+ szolid tumorokat célzó CAR T sejteknek. Ez a felismerés azt a világos üzenetet közvetíti a klinikumnak, hogy CAR T sejtkészítmények előállításnak optimalizálása és az ideális fenotípusprofil meghatározása a kezelt tumor típusának és antigénprofiljának függvényében elengedhetetlen feltétele a sikeres klinikai kipróbálásnak.Chimeric antigen receptor (CAR) modified T cells brought a paradigm shift in the treatment of chemotherapy-resistant lymphomas, but clinical experience in the context of solid tumors has been disheartening. While incorporating CD28 or 41BB costimulatory domains into CARs in addition to the CD3z signaling domain improved the long-term efficacy of T cell products, their influence on early tumor engagement has not yet been elucidated. Our initial investigations focused on the effects of CD28 and 41BB costimulatory domains on the surface organization, diffusion kinetics, and early cytolytic activity of first (.z), second (CD28.z, 41BB.z), and third (CD28.41BB.z) generation CARs. Our results indicate that while .z and CD28.z CARs form dimers cumulated into large membrane clusters, 41BB-containing CARs are mainly present in oligomeric form and organize into small membrane clusters. Lateral diffusion of CARs showed a proportional increase with the distance of the CD3z domain from the membrane plane. Upon initial interaction with tumor cells, both highly mobile CD28.41BB.z CAR oligomers and their compact clusters, as well as the large pre-assembled clusters of .z CARs, mediated more efficient proximal signaling than the moderately mobile CD28.z and 41BB.z CARs. However, during the first day of tumor contact, the CD28.41BB.z CAR performed the worst in sequential short-term elimination of adherent tumor cells, while the .z CAR was superior to all others. We conclude that the molecular structure, membrane organization, and mobility of CARs are critical design parameters that need to be considered alongside the long-term biological effects of costimulatory domains to achieve an optimal therapeutic effect. In the second part of our study, we examined the long-term efficacy of CAR T cells, in which the composition of the cell product plays a significant role. Correlative clinical studies of patients with hematological malignancies have suggested that products rich in less differentiated cytotoxic CD8+ T cells exhibit the most favorable anti-tumor efficacy. However, in our solid tumor models the more differentiated CAR T cell products enriched in the effector memory phenotype exhibited stronger in vitro cytotoxicity and proliferative potential compared to cell populations where differentiation was restricted during the manufacturing stage. Furthermore, we observed that 41BB costimulation and the use of RetroNectin during T cell expansion led to a significant decrease in the proportion of CD4+ cytotoxic CAR T cells. Our preclinical model demonstrated that differentiation toward the effector memory phenotype and a balanced CD4+/CD8+ ratio confer the most potent expansion and cytolytic efficacy for CAR T cells targeting HER2+ solid tumors. These insights emphasize that optimizing CAR T cell product manufacturing and determining the ideal phenotypic profile based on the type and antigen profile of the treated tumor are essential prerequisites for successful clinical trials.122huHER2-pozitív tumorokHER2-positive tumorskiméra antigén receptor (CAR)immunterápiasejtterápiaimmunológiai szinapszisfluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS)receptor mobilitásreceptor szerveződésT sejt expanzióT sejt perzisztenciaT sejt fenotípuschimeric antigen receptor (CAR)immunotherapycell therapyimmunological synapsefluorescence correlation spectroscopy (FCS)receptor mobilityreceptor clusteringT cell expansionT cell persistenceT cell phenotypeGyógyszertudományokOrvostudományok