Demény, Máté ÁgostonKiss, Fanni2022-01-212022-01-212021http://hdl.handle.net/2437/328084A több mint 20 ismert ADP-riboziltranszferáz (ART) által létrehozott fehérjemódosítások nagy része a szabályozott folyamatokkal együtt még felderítésre vár. Különösen igaz ez a mono(ADP-ribóz) (MAR) fehérjemódosításokra. A fehérjék ADP-ribóz (ADPr) módosítása kölcsönható fehérjék révén vezet biológiai következményekhez, amelyek sztereospecifikusan kapcsolódó fehérjedomének segítségével ismerik azt fel. A specifikus és kellően nagy affinitású kölcsönható fehérje darabok elméletileg felhasználhatók az ADP-riboziláció felismerését igénylő preparatív vagy analítikai eljárásokban helyettesítve az ADP-ribóz elleni antitesteket. Mi az Archeoglobus fulgidus archea Af1521 fehérjéjének makrodoménjét vizsgáltuk, melynek cDNS-ét a DNASU plazmid gyűjteményéből szereztük be. Az Af1521 makrodoménen az irodalom alapján 3 aminosavcserét hajtottunk végre irányított mutagenezissel, melyek az ADP-ribóz iránti affinitását 1000-szeresére növelik („enhanced” Af1521 - eAf1521). Ezt követően a domént 6xHis-tag-elt formában E. coli-ban expresszáltuk és tisztítottuk. Az eAf1521 alkalmasnak bizonyult H2O2 stimulusfüggően ADP-ribozilált fehérjék kimutatására HeLa sejtek lizátumában farwestern blot során. A fluoreszcensen jelölt eAf1521 segítségével pedig láthatóvá tudtuk tenni a H2O2 hatására megjelenő magi ADP-ribozilációt direkt immunfluoreszcens eljárással analóg ADP-ribóz jelölés révén. Érdekes felismerésként a kezeletlen HeLa sejtekben perinukleáris hálózatos festődést tapasztaltunk, amit a poli(ADP-ribóz) (PAR) elleni antitest nem mutatott ki, valószinűsítve, hogy MAR módosításokról van szó. A mintázat mitokondriumoknak való megfelelését MitoTracker SOX Red festékkel történő kolokalizálás révén igazoltuk. A festődés H2O2 kezelés hatására 2-4 perc alatt eltűnt. A mitokondriális elektrontranszportláncot gátló vegyületek (rotenon, antimicin) a festődés erősödését idézték elő, a belső mitokondriális membrán által elválasztott terek között fennálló H+-grádienst megszüntető ionofór (CCCP) pedig a jelölődés teljes elhalványodásához vezetett. A jelölődés változatlan megléte PARP1 KO sejtekben kizárta, hogy a PARP1 volna érte felelős. Eredményeink igazolják az Af1521 makrodomén felhasználhatóságát több, az ADP-riboziláció szerepét vizsgáló módszerben, továbbá egybehangzanak azokkal az irodalmi adatokkal, amelyek szerint az ADP-riboziláció jelen van a mitokondriumban, és ott valószínűleg funkcionális szereppel bír.43huADP-ribozilációADP-ribóz kötő fehérjedoménmakrodoménPARP-1DEENK Témalista::Orvostudomány