Sramkó, GáborMalkócs, Tamás2022-04-252022-04-252022http://hdl.handle.net/2437/331616Dolgozatomban négy esettanulmányon keresztül tettem kísérletet arra, hogy bemutassam néhány, nemzetközileg széleskörűen, hazánkban kevésbé használt genetikai módszer alkalmazhatóságát a botanikai kutatásokban. Az első két esettanulmányban két, fokozottan védett növényfajban fejlesztett mikroszatellit markereket teszteltünk, bemutattuk alkalmazhatóságukat populációgenetikai kutatásokban, és teszteltük potenciális alkalmazhatóságukat közelrokon fajokban. A harmadik esettanulmányban a fokozottan védett, endemikus faj, a magyarföldi husáng (Ferula sadleriana Ledeb.) átfogó természetvédelmi célú populáció genetikai vizsgálatát végeztük el, kitérve a faj filogenetikai helyzetére, populációgenetikai struktúrájára, demográfiai helyzetére, illetve ezen ismeretek természetvédelmi interpretációjára. A negyedik esettanulmányban egy szélesebb elterjedésű fajról, az osztrák zsályáról (Salvia austriaca Jacq.) bizonyítottuk be, hogy valójában két különálló fajt rejt. A két faj különállását elterjedésük, morfológiai eltéréseik, illetve genomi alapú faji lehatárolás segítségével bizonyítottuk be, kitérve a fajok filogenomikai kapcsolatára, elválásuk idejére, valamint az alkalmazott genomi módszer (RADseq) a Salvia nemzetségen belüli filogenomikai alkalmazhatóságára. A mocsári kardvirág (Gladiolus palustris Gaud.) Közép-Európa endemikus faja. A faj egy veszélyeztetett élőhelyen, a nedves rétek és száraz gyepek közötti ökotonban fordul elő, ezért teljes elterjedési területén visszaszorulóban van. Szerepel az Európai Unió Élőhelyvédelmi Irányelvének II. mellékletében, valamint több nemzeti vörös listán. A G. palustris hatékony védelme érdekében olyan genetikai markereket azonosítottunk, amelyek a populáció szintjén biztosítanak felbontást. Kutatásunk során 15 mikroszatellit markert azonosítottunk a fajban, melyek közül 11 bizonyult polimorfnak. Eredményeinkben e 11 marker alapján három populáció genetikai mérőszámait közöljük, melyekből például az egyes populációk genetikai diverzitása, vagy a populációk közötti génáramlás mértéke állapítható meg. Továbbá megmutattuk, hogy az általunk azonosított markerek két rokon fajban is alkalmazhatóak lehetnek. Megállapítottuk, hogy az általunk azonosított markerek hasznos eszközt képviselnek a faj további populációgenetikai vizsgálatához. A F. sadleriana egy Kárpát-medencei endemikus faj, melynek mindössze nyolc populációja ismert, ezért minden populációja fokozottan védett. Az IUCN Vörös Listáján a veszélyeztetett kategóriába sorolják, és szerepel az Európai Unió Élőhelyvédelmi Irányelvének II. és IV. mellékletében. A F. sadleriana sziklás, száraz gyepek, sztyepprétek és pannon molyhos tölgyes karsztbokorerdők mozaikjában fordul elő, és több tényező, például vadrágás, túrázók általi taposás, illetve nyílt élőhelyének záródása fenyegeti. A faj megőrzése érdekében több, ex situ védelmi intézkedés történt, azonban ezek csak részlegesen dokumentáltak. A második esettanulmányban 13 mikroszatellit marker fejlesztését írtuk le a magyarföldi husángban, majd e 13 markert jellemeztük, és bemutattuk populációgenetikai alkalmazhatóságukat néhány általánosan használt mérőszámon keresztül, három populáció felhasználásával. Az amplifikáció hatékonyságát két közel rokon fajban teszteltük. Megállapítottuk, hogy az általunk azonosított markerek kiválóan alkalmasak a magyarföldi husáng populációgenetikai vizsgálatára, és a Ferula nemzetségen belül szélesebb körben is alkalmazhatóak lehetnek. A harmadik esettanulmányban a magyarföldi husáng a Ferula nemzetségen belül elfoglalt filogenetikai helyzetét határoztuk meg a sejtmagi riboszomális ITS szekvencia felhaszálásával, a második esettanulmányban leírt 13 mikroszatellit marker segítségével pedig megvizsgáltuk a faj összes populációjának genetikai állapotát, a populációk közötti genetikai kapcsolatokat, illetve igyekeztünk feltárni evolúciós és demográfiai történetüket. Megállapítottuk, hogy a Ferula sadleriana legközelebbi rokonai az Eurázsiai sztyeppén honos Ferula tatarica Fisch. ex Spreng. és Ferula songarica Pall. Ex Schult. Megállapítottuk továbbá, hogy az összes populáció viszonylag magas genetikai diverzitással bír, mely a faj életmenet stratégiájának köszönhetően, a kis populációméretek negatív hatását kiegyenlítve alakulhatott ki. A populációk egymástól viszonylag elszigeteltek, bár jól tettenérhetőek az ex situ fajvédelmi programokból származó betelepítések hatásai, és eredményeink két populáció esetében nem zárják ki azok telepített eredetét. További természetvédelmi kezelésként javasoljuk az eddigi intézkedések megtartását, valamint a populációk egyedszámának szorosabb követését és az egyes populációk különálló genetikai egységként való kezelését a potenciális jövőbeli telepítések tervezésénél. A zsályák (Salvia L.) az ajakosvirágúak családjának legnépesebb nemzetsége, mely több, mint ezer fajt számlál. A nemzetség egyedülálló evolúciós újítása a virág felépítésében rejlik, mivel a módosult porzók mintegy emelőszerkezetszerűen működnek, ugyanis a beporzó a nektár elérése érdekében a porzó steril alsó csatlóját elmozdítva a felső csatlón található portokot maga felé mozdítja el, így elhelyezve a pollent. Ez az emelőszerkezet mechanizmus bizonyítottan szerepet játszik a nemzetségen belüli fajképződési eseményekben, mivel lehetővé teszi a szimpatrikusan előforduló, egyszerre virágzó fajoknak, hogy ugyanazt a pollinátort használják, a hibridizáció elkerülése mellett. Terepi kutatásaink során azonosítottunk egy Salvia taxont, amely az osztrák zsályától gyakorlatilag megkülönböztethetetlen pusztán vegetatív jellegek alapján, azonban radikálisan eltérő virágmorfológiát képvisel. A negyedik esettanulmányban e taxon rendszertani hovatartozását igyekeztünk feltárni, melyhez vizsgáltuk földrajzi elterjedésének határait online fényképes adatbázisok, illetve saját megfigyeléseink alapján, a közte és az osztrák zsálya között megfigyelhető morfológiai eltéréseket a nemzetségben már kipróbált morfometriai módszerek segítségével, valamint az osztrák zsályához való genetikai viszonyát a RADseq genomi módszerhez kapcsolt Bayes-faktor alapú faji lehatárolás, Bayesiánus fajfa rekonstrukció valamint a két taxon elválásának molekuláris datálásának segítségével. Kitértünk továbbá a RADseq módszernek a Salvia nemzetségben való szélesebb körű alkalmazhatóságára. Megállapítottuk, hogy az általunk azonosított Salvia taxon nem fordul elő együtt az osztrák zsályával, és míg az előbbi az eurázsiai sztyeppe valódi sztyeppzónájában fordul elő, utóbbi a Pannon- és eurázsiai erdős sztyeppén, illetve a Krím-félsziget déli részén található meg. A morfometriai elemzések megmutatták, hogy míg a vegetatív jellegekben nem tapasztalható különbség a két taxon között, a virágjellegekben szignifikáns és konzisztens eltérések figyelhetők meg. Az összes filogenomikai eredményünk a két taxon faji szintű elkülönülését támogatta, és elválásuk idejét 197 ezer évvel ezelőttre becsültük, korábbra, mint két általánosan elismert faj, a mezei (Salvia pratensis L.) és a ligeti zsálya (Salvia nemorosa L.) elválását. Ezen eredményeink alapján a taxont az esettanulmány alapjául szolgáló szakcikkben a tudomány számára új fajknét írjuk le. A RADseq módszerrel teljes bizonyossággal el tudtuk különíteni a Plethiosphace fajcsoport fajait, ebből pedig arra következtethetünk, hogy a módszer más fajcsoportokon belül, de akár az egész Salvia nemzetségen belül alkalmas lehet a fajok leszármazási viszonyainak nagy bizonyossággal való feltárására. Az esettanulmányainkban bemutatott módszerek a botanikai kutatások más- más részterületén alkalmazhatóak a leghatékonyabban. Míg az nrITS szekvencia Sanger-szekvenálása alacsony költségek és munkaidő befektetés mellett kivitelezhető, az leginkább csak mély filogenetikai elválások vizsgálatára alkalmas. A mikroszatellit markerek fejlesztése, majd alkalmazása mind a költségek, mind a befektetett idő és munka tekintetében a legmegterhelőbb, ezért (amennyiben nem állnak rendelkezésre már korábban azonosított markerek) kifejlesztésük és használatuk leginkább sok (több száz) egyed vizsgálata, vagy hosszabb távú vizsgálatok esetén térülhet meg. A RADseq módszer is viszonylag költséges, és egy könyvtár limitált számú egyedet tartalmazhat (~100), ellenben kevés munkaidőt vesz igénybe, és a kapott adat mennyisége nagyságrendekkel magasabb az előző két módszerrel elérhetőnél. Ennek a módszernek is megvannak ugyanakkor a hátrányai, például kevésbé alkalmas mély filogenetikai elválások vizsgálatára, és az adatok feldolgozása során használt beállítások nagyban befolyásolhatják az eredményeket, így például nehézkessé téve két különböző beállításokkal végzett populációgenetikai vizsgálat eredményeinek összehasonlítását, akár ugyanazon fajon belül is.In my thesis, I have attempted to demonstrate the applicability of some internationally widely used genetic methods in botanical research, which are less widely used in our country, through four case studies. In the first two case studies, we tested microsatellite markers developed in two endangered plant species, demonstrated their applicability in population genetics research, and tested their potential applicability in closely related species. In the third case study, we conducted a comprehensive conservation genetics study of the endemic, endangered species, Ferula sadleriana Ledeb., covering its phylogenetic status, population genetic structure, demographic status and the interpretation of this knowledge for conservation. In the fourth case study, we demonstrated that a species with a wide distribution, Salvia austriaca Jacq. constitutes of two separate species. The distinctness of the two species was demonstrated by means of their distribution patterns, morphological differences, species delimitation, including the phylogenomic relationship of the species, the time of their separation and the phylogenomic applicability of the used genomic method (RADseq) within the genus Salvia L. The marsh gladiolus (Gladiolus palustris Gaud.) is an endemic species of Central Europe. The species occurs in an endangered habitat, the ecotone between wet meadows and dry grasslands, and is therefore in decline throughout its range. It is included in Annex II of the European Union Habitats Directive and in several national red lists. To ensure effective conservation of G. palustris, genetic markers have been developed that provide resolution at the population level. During our research, we developed 15 microsatellite markers in the species, 11 of which we have found to be polymorphic. In our results, we report genetic metrics for three populations based on these 11 markers, which can be used to determine, for example, the genetic diversity of each population or the degree of gene flow between populations. Furthermore, we show that the markers we have developed can be used in two related species. We conclude that the markers we developed represent a useful tool for further population genetics studies of this species. F. sadleriana is a Carpathian Basin endemic species with only eight known populations, all of which are strictly protected. It is listed as threatened on the IUCN Red List and is included in Annexes II and IV of the European Union Habitats Directive. F. sadleriana occurs in a mosaic habitat of rocky, dry grasslands, steppe slopes, and Pannonian karst white oak low woods and is threatened by a number of factors, including grazing by big game, trampling by hikers and closure of its open habitat. Several ex situ conservation measures have been taken to conserve the species, but these are only partially documented. In the second case study, we described the development of 13 microsatellite markers in F. sadleriana, characterized these 13 markers and demonstrated their population genetic applicability through some commonly used metrics using three populations. The efficiency of amplification was tested in two closely related species. We conclude that the markers we have developed are suitable for population genetic studies of F. sadleriana and may have wider applicability within the genus Ferula L. In the third case study, we determined the phylogenetic position of F. sadleriana within the genus Ferula using the nuclear ribosomal ITS sequence, and using the 13 microsatellite markers described in the second case study, we investigated the genetic status of all known populations of the species, the genetic relationships between populations, and sought to elucidate their evolutionary and demographic history. We found that the closest relatives of F. sadleriana are Ferula tatarica Fisch. ex Spreng. and Ferula songarica Pall. Ex Schult., both native to the Eurasian steppe. We also found that all populations have relatively high genetic diversity, which may be the result of the species' life history strategy, offsetting the negative effect of small population sizes. The populations are relatively isolated from each other, although the effects of introductions from ex situ conservation programmes are clearly evident, and our results do not exclude the possibility of introduced origin of two populations. As further conservation treatment, we recommend maintaining the current measures, as well as closer monitoring of population numbers and treating each population as a separate genetic unit when planning potential future introductions. Salvia is the largest genus of the Lamiaceae family, with over a thousand species. The unique evolutionary innovation of the genus lies in the flower structure, with modified stamens acting as a kind of lever, whereby the pollinator, in order to reach the nectar, pushes in the lower, sterile connective arm of the stamen, moving the fertile upper connective towards itself, thus depositing the pollen. This lever mechanism has been shown to play a role in speciation events in the genus by allowing sympatrically occurring, co-flowering species to use the same pollinator while avoiding hybridization. In our field studies, we identified a Salvia taxon that is virtually indistinguishable from S. austriaca looking at only vegetative traits, but has a radically different floral morphology. In the fourth case study, we sought to elucidate the taxonomic placement of this taxon by examining the limits of its geographic distribution based on online photographic databases and our own observations, the morphological differences between it and S. austriaca using morphometric methods already tested in the genus, and its genetic relationship to S. austriaca using Bayes-factor species delimitation coupled with the RADseq genomic method, Bayesian species tree reconstruction and molecular dating of the separation of the two taxa. We also discuss the wider applicability of the RADseq method in the genus Salvia. We found that the Salvia taxon we identified does not co-occur with S. austriaca, and while the former occurs in the true steppe zone of the Eurasian steppe, the latter is found in the Pannonian and Eurasian forest-steppe and in the southern Crimean Peninsula. Morphometric analyses showed that while no differences in vegetative characters were observed between the two taxa, significant and consistent differences in floral characters were observed. All of our phylogenomic results supported the separation of the two taxa at the species level, and we estimated the time of their separation to have happened 197,000 years ago, earlier than the separation of two commonly recognized species, S. pratensis and S. nemorosa. Based on these results, we describe the taxon as a new species for science in the paper on which this case study is based on. The RADseq method has allowed us to delimit species of the Plethiosphace section with complete certainty, and we conclude that the method may be useful for revealing the relationships within other sections, or even within the entire Salvia genus, with high confidence. The methods presented in our case studies can be applied most effectively in different areas of botanical research. While the Sanger-sequencing of the nrITS sequence is feasible at low cost and labour investment, it is mostly only suitable for the study of deep phylogenetic splits. The development and subsequent use of microsatellite markers is the most costly, both in terms of time- and labour investment, and therefore (when previously developed markers are not available) their development and use is most cost-effective for studies involving many (hundreds) of individuals or longer-term studies. The RADseq method is also relatively costly and can contain a limited number of individuals per library (~100), but it requires fairly little labour and the amount of data obtained is orders of magnitude higher than that of the previous two methods. However, this method also has its drawbacks, such as being less suitable for studying deep phylogenetic relationships and that the settings used to process the data can have a strong influence on the results, making it difficult, for example, to compare the results of two population genetic studies with different settings, even within the same species.132hubotanikafilogenetikapopulációgenetikatermészetvédelembotanyphylogeneticspopulation geneticsconservationTermészettudományok