Boratkó, AnitaThalwieser, Zsófia2018-04-262018-04-262018http://hdl.handle.net/2437/250317A protein foszfatáz 2A (PP2A) a Ser/Thr specifikus foszfatázok csoportjába tartozik. Szerkezetét tekintve három alegységből áll, melyek közül a változatos B alegység határozza meg a holoenzim szubsztrátspecificitását, valamint a sejten belüli lokalizációját. Munkacsoportunk korábban kimutatta, hogy az endotél sejtekben a flotillin-1 fehérje, a B55α regulátor alegységet tartalmazó PP2A holoenzimmel hat kölcsön. A kölcsönhatást a fehérjék ko-lokalizációjával, immunprecipitációval és pull down kísérletekkel igazoltuk. Irodalmi adatokból tudjuk, hogy a protein kináz C (PKC) enzim a flotillin-1 fehérjét a Ser315 oldalláncon foszforilálja. Jelenlegi munkánk célja volt annak vizsgálata, hogy a flotillin-1 lehet-e a PP2A szubsztrátja. Tüdő artéria endotél sejtekben siRNS technikával depletáltuk a PP2A regulátor Bα alegységét, melynek hatására a flotillin-1 a sejtmag körül dúsult fel. Ugyanezt a változást láttuk a PKC enzim aktiválásakor, valamint a PP2A okadánsavval történő gátlásakor is. Proximity ligation assay (PLA) módszerrel kimutattuk, hogy a PKC enzim aktivációjakor a flotillin-1 és PP2A Bα közötti kölcsönhatás sokkal kifejezettebb lett. Rekombináns DNS technikával létrehoztuk a flotillin-1 foszorilációt utánzó (S315D) és foszfonull (S315A) mutánsait. A kísérletekhez a flotillin-1 kódoló szakaszokat emlős expresszióra alkalmas pcDNA3.1/myc-His vektorba, míg a bakteriális expresszióhoz pGEX-4T-2 vektorba klónoztuk. Az endotél sejtekben optimalizáltuk a rekombináns fehérjék overexpresszióját, majd lokalizációjukat immunfluoreszcens festéssel, míg a PP2A Bα fehérjével való kölcsönhatásukat immunprecipitációs kísérletekkel ellenőriztük. Bakteriális expresszióval előállítottuk a GST-flotillin-1 mutáns fehérjéket, melyeket pull down módszerben használtunk fel. A kölcsönhatás kinetikai vizsgálatához az ún. NanoBiT rendszerrel tervezünk vizsgálatokat, amelyhez a szükséges rekombináns plazmidokat már létrehoztuk. Eredmények alapján elmondhatjuk, hogy az endotél sejtekben a flotillin-1 fehérje foszforiláció függő módon hat kölcsön a PP2A Bα holoenzimmel, valamint hogy a PKC által foszforilált flotillin-1 a PP2A enzim szubsztrátja lehet.45huflotillin-1protein foszfatáz 2Afehérje fehérje kölcsönhatásendotél sejtekfoszforilációDEENK Témalista::Biológiai tudományok