Szöllősi, JánosSebestyén, Zsolt2007-06-202007-06-202002http://hdl.handle.net/2437/2429Munkánk célja az volt, hogy lehetséges magyarázatot keressünk a különböző CD45 izoformák szerepére a TCR jelátvitel szabályozási folyamataiban CD45R0+, CD45RBC+ és CD45RABC+ HPB-ALL T sejtek felszínén kialakított receptor kölcsönhatások és jelátviteli mechanizmusok vizsgálatával. Munkánkhoz az áramlási citometriás fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FCET) módszer továbbfejlesztését is célul tűztük ki, mivel a módszer klasszikus változata alacsony receptor expressziójú rendszereken nem volt használható. Vizsgálataink eredményei a következők: (1) A vörös tartományban emittáló Cy3 és Cy5 fluoreszkáló festékek alkalmazásával jelentős mértékben csökkent az autofluoreszcencia mértéke a korábban alkalmazott fluoreszcein-rodamin FRET festék párhoz képest. Egy negyedik független fluoreszcencia paraméter detektálása lehetővé tette, hogy új matematikai algoritmus kifejlesztésével az autofluoreszcencia sejtenkénti korrekcióját végezzük el, ami a FCET módszer megbízhatóságát és pontosságát nagymértékben növelte. (2) Az új, megnövekedett érzékenységű FCET módszerrel sikerült olyan sejtpopulációkat megkülönböztetni egymástól, amelyek csak felszínükön vizsgált molekulák között mért FRET hatékonyság tekintetében tértek el egymástól. (3) Az új FCET módszer alkalmazhatóságának határát is vizsgáltuk különböző immunfluoreszcens jelölési sémákra. MHC-I molekulák nehéz és könnyű láncait különböző direkt illetve indirekt módszerekkel jelezve azt találtuk, hogy az epitópok között detektálható energia transzfer hatékonyságot az alkalmazott antitest komplexum mérete jelentős mértékben befolyásolja. Míg a legmagasabb FRET értékeket mindkét epitóp direkt jelzése eredményezte, addig másodlagos antitestek használatával a mérhető transzfer hatékonyság nagymértékben lecsökkent. (4) A továbbfejlesztett FCET módszerrel elsőként mutattuk ki, hogy HPB-ALL T sejtek felszínén csak a CD45R0 izoformák alkotnak homoasszociátumokat, a nagyobb izoformák, mint a CD45RBC és CD45RABC nem. A CD45R0 izoformák esetében további szoros molekuláris kölcsönhatást találtunk a CD4/CD8 ko-receptorokkal. A CD45RBC és CD45RABC esetén hasonló együttállást nem találtunk. (5) Sikerült kimutatni a CD45R0+ T sejtek megemelkedett CD4-asszociált p56lck alap kináz aktivitását, és a TCR jelátvitel megnövelt aktivitású foszforilációs eseményeit, ami jól egyezik a receptor mintázat eltéréseivel.65, [20] p336560 bytes226343 bytes1412057 bytesapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfhuA egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés csak a szerzői jogok maradéktalan tiszteletben tartásával használhatókPhD, doktori értekezésElméleti orvostudományokOrvostudományok