Nagy, PéterKovács, Tamás2018-04-032018-04-032018http://hdl.handle.net/2437/249019A membránpotenciál legkevésbé ismert komponense, a dipólpotenciál a membránt alkotó lipidek karbonil csoportjainak és a membránhoz asszociálódó vízmolekulák dipólmomentumainak rendezett orientációja révén alakul ki. A dipólpotenciál az egyéb membránpotenciáloknál jóval erősebb elektromos erőteret generál, amely révén befolyásolja számos fehérje transzmembrán doménjének (TMD) feszültségfüggő konformációváltozásait. Bár az ErbB receptorok (ErbB1-4) aktivációja az intermolekuláris kölcsönhatások által mediált oligomerizáción keresztül történik, a TMD szerepe nem ismert a folyamatban. Bár a dipólpotenciál megváltoztathatja a transzmembrán peptidek konformációját, ErbB fehérjékre gyakorolt hatása azonban még ismeretlen. Kísérleteink során áramlási citometriás Förster rezonancia energia transzfer (FRET) mérések és konfokális mikroszkópos felvételeken végzett number and brightness (N&B) analízis segítségével kimutattuk, hogy a dipólpotenciál növekedése felerősíti az ErbB1 és ErbB2 receptorok közötti homo- és heteroasszociációk epidermális növekedési faktor (EGF) hatására bekövetkező növekedését. Ezen hatások még jelentősebbeknek bizonyultak a TMD-ben egy aktiváló Val → Glu mutációt hordozó ErbB2 (NeuT) esetén. Az receptorok jelátviteli kapacitása korrelált a dipólpotenciál nagyságával. Mivel a dipólpotenciál növekedése csökkentette az EGF ErbB1 iránti affinitását, a növekedési faktor felerősített hatásai csökkent receptortelítettség mellett következtek be. Eredményeinkből arra következtettünk, hogy a megnövekedett dipól potencál által indukált dimerizáció a TMD-n keresztül a receptor aktivációjához vezet az extracelluláris domének és TMD-k közötti kölcsönhatások által stabilizált dimerekben. A dipólpotenciál az ErbB receptorok klaszterizációjában permisszív szerepet tölthet be és a lipidtutajok receptor tirozin kinázokra gyakorolt hatásai mögött részben a dipólpotenciál állhat. Elméleti megfontolások és modellmembránok vizsgálatából származó közvetett kísérletes bizonyítékok alapján a dipólpotenciál nagysága magasabb lehet a lipidtutajokhoz több szempontból hasonlító folyékony rendezett doménekben. Három különböző dipólpotenciálra érzékeny fluorofór és négy különböző raft, illetve non-raft marker segítségével konfokális felvételek kvantitatív elemzése során élő sejtek esetén is bebizonyítottuk, hogy a dipólpotenciál magasabb a tutajokban a membrán egyéb régióihoz képest. A különbség elég jelentősnek tűnik ahhoz, hogy a fehérjék TMD-jeinek konformációja különböző legyen a raft és non-raft régiókban. A Gaucher-kórra jellegzetes szfingolipidekben gazdag és kontroll sejtek dipólpotenciáljának összehasonlítása során hasonló mértékű eltérést tapasztaltunk, amely a megfigyeléseink patofiziológiai jelentőségére utalhat. Eredményeink megerősítették, hogy élő sejtek membránjában a dipólpotenciál laterális heterogenitása korrelál a lipidtutajok jelenlétével és a sejtmembrán lipidösszetételében bizonyos betegségek esetén bekövetkező eltérések a dipólpotenciál jelentős megváltozását eredményezhetik. A largely unknown component of the membrane potential, the dipole potential, is generated by the ordered orientation of lipid carbonyl and membrane-attached water dipole moments. The dipole potential, generating an electric field much stronger than any other type of membrane potential, influences a wide array of phenomena including voltage-dependent conformational changes of the transmembrane domains (TMD) of proteins. Although activation of ErbB receptors (ErbB1-4) is driven by oligomerization mediated by intermolecular interactions, the TMD has been largely neglected in this regard. The dipole potential alters the conformation of transmembrane peptides, but its effect on ErbB proteins was unknown. In our experiments, we showed using flow cytometric Förster resonance energy transfer (FRET) and number and brightness (N&B) analysis in confocal microscopy that the epidermal growth factor (EGF)-induced increase in the homoassociation of ErbB1 and ErbB2 and their heteroassociation are augmented by increasing the dipole potential. These effects were even more pronounced for ErbB2 harboring an activating Val → Glu mutation in the transmembrane domain (NeuT). The signaling capacity of ErbB1 and ErbB2 was also correlated with the dipole potential. Since the dipole potential decreased the affinity of EGF to ErbB1, the augmented growth factor-induced effects at an elevated dipole potential were actually induced at lower receptor occupancy. We concluded that dimerization induced by an elevated dipole potential will bring about TMD-driven receptor activation leading to increased signaling mediated by dimers stabilized by interactions among the extracellular domains and the TMDs. The dipole potential may play a permissive role in the clustering of ErbB receptors, and the effects of lipid rafts on receptor tyrosine kinases can be partially attributed to the dipole potential. Theoretical considerations and indirect experimental evidence obtained in model membranes suggested that the dipole potential is larger in liquid-ordered domains believed to correspond to lipid rafts in cell membranes. Using three different dipole potential-sensitive fluorophores and four different labeling approaches of raft and non-raft domains we showed by quantitative confocal image analysis that the dipole potential is indeed stronger in lipid rafts than in the rest of the membrane. The magnitude of this difference seemed to be large enough so that the conformation of the TMD is altered when proteins move into or out of lipid rafts. The magnitude of this difference was similar to that observed between the dipole potential in control and sphingolipid-enriched cells characteristic of Gaucher’s disease, pointing to a potential pathophysiological role for these findings. Our results established that the heterogeneity of the dipole potential in living cell membranes was correlated with lipid rafts and implied that alterations in the lipid composition of the cell membrane in human diseases can lead to substantial changes in the dipole potential.137huErbB receptoroklipidtutajokdipólpotenciálErbB receptorslipid raftsdipole potentialElméleti orvostudományokOrvostudományok