Kiss , AndreaZáhorszki, Sándor Richárd2024-05-092024-05-092024-04-03https://hdl.handle.net/2437/369778A miozin foszfatáz (MP) protein foszfatáz-1 (PP1) típusú holoenzim, amelyben a PP1cδ katalitikus alegység miozinhoz is kötődő regulátor alegységhez (MYPT1) kapcsolódik. A miozin defoszforilációja - és ezáltal a simaizom kontrakció regulációja – mellett kimutatták a MP szerepét számos nem-kontraktilis sejtfolyamat, többek között a sejtciklus és a sejtosztódás szabályozásában, csökkent aktivitása pedig hozzájárulhat a daganatsejtek proliferációjához és metasztázisához. A MP gátlása részben a MYPT1 alegység Thr696 és Thr853 oldalláncainak foszforilációja által valósul meg. Ezen gátló helyek foszforilációját számos kináz katalizálhatja, míg a defoszforilációjukban (a MP aktiválásában) elsősorban protein foszfatáz-2A (PP2A holoenzimek szerepét feltételezik. A célrairányító regulátor B alegység(ek)et azonban eddig nem azonosították. Az epigallokatechin-gallát (EGCG) a PP2A és a MP koordinált aktivációját okozza a 67 kDa laminin receptor (67LR) → cAMP/PKA → PP2A → MP jelátviteli útvonalon keresztül. Korábban kimutatták, hogy a PKA a B56δ regulátor alegység foszforilációja révén fokozza a PP2A aktivitást idegsejtekben, ám ennek a foszforilációnak a szerepét az EGCG által indukált foszfatáz aktiválásban még nem vizsgálták. Jelen kísérleteink célja, hogy feltárjuk a B56 fehérjecsalád részvételét, valamint a MP holoenzimmel való interakciójukat az EGCG/67LR útvonalban. Az aminosav szekvenciák összehasonlításával megállapítottuk, hogy a PKA- foszforilációs helyet körülvevő szakasz a B56δ mellett a B56γ3 izoformában is jelen van. A B56 fehérjéket HEK293AD sejtekben expresszáltuk, majd a PKA aktivátor Forskolinnal való kezelést követően foszfo-specifikus antitest alkalmazásával megvizsgáltuk az izoformák foszforilációját. Eredményeink alapján a B56δ és γ3 izoformák egyaránt foszforilálódnak PKAáltal. EGCG-kezelt sejtekben megvizsgálva a B56 fehérjék foszforilációját egy 61 kDa méretű fehérjesávot detektáltunk, ami vélhetően a B56γ3 izoformának felel meg. A MYPT1 és a B56 alegységek kölcsönhatásának vizsgálatához Flag-MYPT1 és HA-PP2A-B56α/γ3/δ alegységeket együttesen expresszáltunk HEK293AD sejtekben, és anti-Flag antitest használatával immunprecipitációt végeztünk. Mindhárom B56 izoforma detektálható volt a Flag-MYPT1 immunprecipitátumban, ami a kölcsönhatás lehetőségét igazolja ezen fehérjék között. Eredményeink a B56δ és γ3 alegységek szerepét sugallják a MYPT1 defoszforilációjában az EGCG/67LR útvonalban. Kutatásaink hozzájárulnak a PP1 és PP2A foszfatáz holoenzim32huPP2A, miozin foszfatáz, EGCG, B56 alegységek, MYPT1, HEK293ADBiológiai tudományok::BiokémiaHozzáférhető a 2022 decemberi felsőoktatási törvénymódosítás értelmében.