Guttman, AndrásKovács, András2014-04-292014-04-2920142014-04-29http://hdl.handle.net/2437/190743Az emberi vérplazma rendkívül széles koncentrációtartományban (12 nagyságrend) tartalmaz különböző biológiai funkciójú fehérjéket. Nagyfokú összetettsége folytán a közepes vagy kis mennyiségben megtalálható plazmafehérjék jellemzése és azonosítása nehéz, hosszadalmas, és nagy mintamennyiségeket igényel. A monoklonális antitest-proteomika egy olyan proteomikai eljárás, mely komplex biológiai minták ellen termeltetett nagyszámú olyan monoklonális antitestet alkalmaz profilírozásra, melyek antigénjei ismeretlenek. Az antigének azonosításának folyamata: biológiai minták reagáltatása ellenanyagokkal, immunprecipitáció, SDS-PAGE elemzés, Western blot validálás és tömegspektrometriás analízis. Munkám célja egy olyan több száz frakciót tartalmazó Analitkönyvtár előállítása, jellemezése és monoklonális antitest-proteomikai alapú antigénazonosításra való alkalmazása volt, mely a plazmafehérjéket natív állapotban tartalmazza. Előszor 500 ml normál (egybe gyűjtött) humán plazmát albumin- és immunglobulin-mentesítettem, majd növekvő koncentrációjú ammónium-szulfátos kicsapással előfrakcionáltam. A precipitátumokat gélszűréssel, kation- és anioncserével, továbbá hidrofób interakciós kromatográfiával frakcionáltam tovább. Az Analitkönyvtár jellemzése során dot blot és Western blot módszerrel követtem a D vitaminkötő fehérje szeparációs és dúsulási útját a frakcionálás különböző szintjein, majd ismert antigén specificitású monoklonális antitestekkel vizsgáltam 7 olyan fehérje eloszlását a Könyvtárban, melyeket a plazma kellően nagy mennyiségben tartalmaz ahhoz, hogy globális eloszlás vizsgálatára alkalmasak legyenek, emellett betegségekre jellemző markerek is. Az ismeretlen antigénspecificitású monoklonális antitestekhez tartozó antigének azonosítása a monoklonális antitest-proteomika munkamódszerével történt. Munkám során előállítottam egy 783 frakcióból álló Analitkönyvtárat, mely a fehérjéket natív állapotban tartalmazta. Az egyes frakciókban lévő fehérjék száma a néhány 10-től akár nehány 100-ig is terjedhetett. A karakterizálás bizonyította, hogy a Könyvtár alkalmazható monoklonális antitest-proteomikai alapú antigénazonosításra. A monoklonális antitest-proteomikai alapú antigénazonosítás során 8 ellenanyaghoz tartozó antigént sikerült azonosítani. A kapott eredmények alapján az Analitkönyvtár és a kidolgozott módszer alkalmasnak bizonyult monoklonális antitest-proteomikai alapú antigénazonosításra. A tapasztalatok biztatóak a teljes munkafolyamat jövőbeni felhasználhatóságára nézve a biomarker- és egyéb, fehérjeazonosítást célzó kutatások során.87huAnalitkönyvtárAnalyte Librarybiomarkerdot blotfehérjeazonosításfrakcionálásimmunprecipitációkromatográfiamonoklonális antitest-proteomikaplazmatömegspektrometriaWestern blotchromatographyfractionationimmunoprecipitationmass spectrometrymonoclonal antibody proteomicsplasmaprotein identificationElméleti orvostudományokOrvostudományok