Guttman, AndrásDöncző, Boglárka2018-03-072018-03-072018http://hdl.handle.net/2437/248526Az élő sejtek felületét gazdagon borítják különféle szénhidrátláncok, melyek a glikokonjugátumok részeként fontos funkciókat látnak el a szervezet és a sejt életében. A glikoproteinek szénhidrát láncai befolyásolják a hozzájuk kapcsolódó fehérje konformációját, élettartamát, közreműködhetnek a sejt-sejt kölcsönhatásokban továbbá receptorai lehetnek különböző lektineknek vagy antitesteknek. A glikomika tudománya a szénhidrátok felépítését és funkcióit vizsgálja. Mivel az oligoszacharidok megváltozhatnak betegségek hatására, alkalmazhatóak biomarkerként. Az FFPE minták jó alternatívát jelenthetnek a friss/fagyasztott mintákkal szemben, könnyebb és hosszabb ideig való eltarthatóságuk miatt. Az FFPE mintákat több kevesebb sikerrel alkalmazták a genomika területén nukleinsavak izolálására, melyeket azután génexpressziós analízisre használták, valamint a proteomika területén Western blotting analízisre, fordított fázisú fehérje array-re és tömegspektrometriai kutatásokra is. Vizsgálataim során megállapítottam, hogy a fehérjékhez kötött szénhidrátok nem változnak formalin fixálás hatására, így glikomikai kutatásokban is felhasználhatók. Eddig főleg MSI (mass spectrometry imaging) technikát használtak az FFPE minták glikozilációjának vizsgálatára. Azonban ez a technika annak ellenére, hogy egyszerre nagy számú különböző anyag detektálására és meghatározására alkalmas, nem tud különbséget tenni az egyes kötési és pozícionális izomerek között, melyeknek fontos élettani szerepük, és ennek megfelelően biomarker jelentőségük lehet, ezenfelül nagy mennyiségű mintát igényel, mivel viszonylag kis érzékenységgel bír. A kapilláris elektroforézis módszer ellenben olyan nagy felbontású technika, mellyel lehetővé válik az előbbiekben említett izomerek és anomerek elválasztása is. Lézer indukált fluorescenciával alkalmazva nagyfokú érzékenységet érhetünk el. Dolgozatomban azon kérdésekre kerestem a választ, hogy 1) megváltozik-e a glikoproteinek oligoszacharid szerkezete formalinnal való fixálás és formalinos fixálást paraffinba ágyazással kombináló módszer hatására, valamint, hogy 2) lehetséges-e az FFPE szövetmintákból teljes glikánprofil meghatározása ill. az egyes cukorstruktúrák azonosítása. Munkám során standard glikoproteineken, humán szérumon ill. egérből származó tumoros szövetmintán végzett kísérleteimmel sikerült bizonyítanom, hogy a fixálás és a fixálás paraffinba ágyazással, speciális sziálsavas szerkezettől eltekintve, nem változtatja meg a cukorprofilt. Az FFPE egér szövetminták glikomikai analízise során a különböző szövetekből kinyert N-kötött glikánok a szövettípusokra jellemző glikozilációs profilt adtak. Az egyes szövetmintákban található glikánok pontos szerkezetmeghatározását exoglikozidáz mátrix emésztéssel oldottam meg. Megállapítottam, hogy az FFPE minták alkalmasak az N-glikánok kapilláris elektroforetikus analízisére lézer indukált fluorescens detektálással. A jövőben a mintaelőkészítési módszerek fejlesztésével kisebb anyagmennyiségekből is lehetővé válna a cukorstruktúrák azonosítása, valamint nagyobb mintaszámmal el lehet végezni a módszer analitikai validálását.The surface of the living cells is richly decorated with various carbohydrate chains that play important roles in the body and cell life as part of the glycoconjugates. Glycan structures of glycoproteins influence the conformation, determine lifetime of the associated protein, participate in cell-cell interactions, and could be receptors for different lectins or antibodies. The growing field of glycomics explores the structure to function relationship of carbohydrates. As oligosaccharides can change due to diseases, they can be used as biomarkers. FFPE samples represent a good alternative to fresh/frozen samples because of their easier storage and longer shelf-life. So far, FFPE samples have been used to isolate nucleic acids for gene expression analysis in genomics, for reverse phase array Western blotting and mass spectrometry experiments in the proteomics field. In the glycomics field, MSI (mass spectrometry imaging) techniques have only been used to investigate the glycosylation of proteins from FFPE samples. However, despite the fact that it is capable of detecting and determining a large number of different materials at the same time, this technique cannot distinguish between the individual binding and positioning isomers that have an important physiological role and, consequently, biomarker significance. In addition, it requires large amount of sample, as it has relatively low sensitivity. Based on my studies, I have found that carbohydrates are not effected by formalin fixation, so they can be used in glycomic research. Capillary electrophoresis is a high-resolution technique, which enables the separation of isomers and anomers. Using laser-induced fluorescence, high sensitivity can be achieved. In my thesis, I wanted to answer the following questions: 1) whether the oligosaccharide chain of glycoproteins was altered by formalin fixation and paraffin embedding, and 2) would it be possible to determine the complete N-glycan profile of FFPE tissue samples and identify each oligosaccharide structure. During my research, using standard glycoproteins, human sera and mouse tumor tissue samples I confirmed that formalin fixation and paraffin embedding did not change the number of N-glycan peaks detected and only slightly changed their distribution. In the glycomic analysis of FFPE mouse tissue samples, N-linked glycans extracted from different tissues produced distinct glycosylation profile of the tissue types. The exact structure of the oligosaccharides from the individual tissue samples was released by exoglycosidase matrix digestion. In summary, I have determined that FFPE samples are suitable for comprehensive N-glycan analysis. In the future, it would be possible to identify the sugar structures from smaller amounts of materials with the development of sample preparation methods, and to carry out an analytical validation of the method with larger sample number.89huglikoproteinoligoszacharidkapilláris elektroforézisglikánstruktúraglycoproteinoligosaccharideformalinFFPEcapillary electroporesisglycan structureElméleti orvostudományokOrvostudományok