Szabó, GáborNagy, Henrietta2007-06-132007-06-132003http://hdl.handle.net/2437/23961. Kidolgoztunk egy, a funkcionális Pgp kimutatására alkalmas fluoreszcenciás módszert, az AKT eljárást, mely egy konformáció-érzékeny (UIC2) és egy nem konformáció-érzékeny mAt kompetícióján alapul. Megállapítottuk, hogy a Pgp modulációja során bizonyos revertáló szerek (pl. CSA, vinblasztin) és az UIC2 mAt együttes hatására kialakuló konformációs állapotot a másodikként alkalmazott mAt kötődése érzékenyebb módon detektálja (AKT eljárás), mint magának az UIC2 antitestnek a kötődése (UIC2-shift). 2. Az AKT teszt eredményein és irodalmi adatok alapján arra következtettünk, hogy a Pgp – az UIC2 mAt fehérjéhez való kötődése mértékében megnyilvánuló – konformáció-változásának kritikus mozzanata valószínűleg a 4. e.c. hurok területén zajlik. További kísérleteink arra utaltak, hogy a katalitikus ciklus verapamil jelenlétében gyorsan áthalad, vagy kihagyja az UIC2 kötődése számára kedvező konformációs állapotot, míg azt a CSA, vinblasztin vagy ATP-depléció indukálja. ATP-depléciós kísérletekben kimutattuk, hogy az UIC2 számára kedvező konformációs állapotban a fehérjéhez nem kapcsolódik ATP vagy az ATP hidrolízise már megtörtént. 3. Kidolgoztunk egy gyors kísérleti eljárást, amely – calcein AM akkumuláción keresztül – más munkacsoportok által leírt, variábilis és közepes mértékű UIC2 pumpa-gátló hatást reprodukálhatóan teljessé teszi. Ezen eljárás alkalmazásával megállapítottuk, hogy a CSA hatására kialakuló, az UIC2 segítségével rögzíthető konformációs állapotban a fehérje pumpa funkcióját ellátni nem képes. 4. A Pgp topológiai viszonyainak konfokális lézer mikroszkópiás vizsgálata során a fehérje heterogén elhelyezkedését figyeltük meg a sejtmembránban. Sejtfelszíni Pgp Triton X-100-zal való kioldhatóságának vizsgálatával arra következtettünk, hogy az összes Pgp mennyiségének ~ 20 %-a lipid tutajokhoz asszociált és a CSA kezeléssel elkülöníthető kétféle Pgp populáció eltérő lipid mikrokörnyezetben található. Nonidet P-40 detergenssel végzett membrán kioldási kísérletek alapján megállapítottuk, hogy a sejtfelszíni Pgp-k citoszkeletális rögzítettsége modulátor nélkül csak kismértékű, azonban keresztkötés hatására növekszik. 5. Az általunk kifejlesztett AKT eljárás jól reprodukálható a Pgp-t alacsonyabb mértékben kifejező sejtvonalakon is. Így várhatóan a módszer alkalmas klinikai diagnosztikai célokra is. 6. Harminc különböző vegyület és az AKT teszt kapcsolatát vizsgálva megállapítottuk, hogy a CSA-szerű vegyületek csoportjába tartozó anyagok mindegyike hatékony revertáló szere a Pgp-nek.81, [39] p412018 bytes171064 bytes2173407 bytesapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfhuA kéziratos phd munkák csak a szerzői jogok maradéktalan tiszteletben tartásával használhatókElméleti orvostudományokOrvostudományok