Vereb, GyörgyRebenku, István2024-02-122024-02-122024https://hdl.handle.net/2437/366242A digitális patológia gyors fejlődése lehetővé teszi szöveti szintű morfológiai felvételek készítését. Immunhisztokémiai jelölések alkalmazásával ezek a morfológiai jegyek egy vagy két molekula expressziós szintjével korreláltathatóak. Napjainkban a fluoreszcenciás patológiai szkennerek megjelenése és elterjedése zajlik, melyek lehetővé teszik több molekula azonos mintában történő, multiplex jelölésen alapúló vizsgálatát. A Pannoramic Confocal az első digitális patológiai szkenner, amely a hagyományos transzmissziós és fluoreszcenciás képalkotáson túl konfokalitást is biztosít. A szkennert a konfokális képalkotás, stabilitás, pontosság, linearitás és érzékenység szempontjából vizsgáltuk. A konfokális kép pontkiterjedési függvényét aszimmetrikusnak, de térben invariánsnak mértük; ennek alapján dekonvolúciós algoritmust implementáltunk a műszerhez. Az X-Y dimenzióban mért stabilitás és relokalizációs pontatlanság jóval a felbontási határ alatt volt. Az intenzitásválasz lineáris volt (R² ≥0,9996). A kalibrált mérések azt mutatták, hogy indirekt jelölés alkalmazásával sejtenként ≥ 2000 molekula jól detektálható és leképezhető. A megvilágítást vizsgálva azt találtuk, hogy a mikroszkóp megvilágítása aszimmetrikus és inhomogén. Ennek kiküszöbölésére bevezettünk egy korrekciós módszert, amely alkalmas kisebb területről és térben változatos mintákról készült felvételek megfelelő korrekciójára is, valamint megbízható kvantitatív eredményeket ad. Ennek alkalmazásával, ill. a mérési pontosság ismeretében a Pannoramic Confocal alkalmas lehet szövettani metszeteken molekuláris interakciók mérésére. A Förster rezonancia energiatranszfer (FRET) népszerű eszköz a molekuláris kölcsönhatások tanulmányozására, mivel a 1-10 nm-es tartományban igen érzékeny a távolságra. Az intenzitás alapú, spektrálisan korrigált FRET mérési módszer előnye, hogy háromdimenziós, valamint időfüggő mérésekre is alkalmas. Annak érdekében, hogy használható legyen magas autofluoreszcenciájú metszetek mikroszkópos mérése során pixelenkénti autofluoreszcencia korrekcióval, az áramlási citometriában használt sejtenkénti korrekciós algoritmust adaptáltuk. A kidolgozott pixelenkénti autofluoreszcencia korrekció javítja a mérések pontosságát és különösen alacsony szignál/autofluoreszcencia értékek, valamint térben változatos autofluoreszcenciájú minták esetében ajánlható. Az analízis elvégzésére írt Fiji/ImageJ plugin szabadon elérhető. A mérési eljárást a Pannoramic Confocal készülékkel is teszteltük, ahol a sejteken és fagyasztva metszett szöveten mért FRET hatásfokok a kontrollként használt LSM 880 lézerpásztázó mikroszkóppal mértekkel egyezést mutattak. Ez alapján a pixelenkénti autofluoreszcencia korrigált FRET mérés implementálásra került a Pannoramic Confocal digitális patológiai szkenner szoftverében, megteremtve a diagnosztikai célú FRET mérések metodológiai és instrumentális alapját.The rapid development of digital pathology allows morphological imaging at the tissue level. Using immunohistochemical markers, these morphological features can be correlated with the expression level of one or two molecules in the same slide. The recent emergence of fluorescence pathology scanners, however, allows multiplex detection of several molecules in the same sample. The Pannoramic Confocal is the first digital pathology scanner to provide confocal imaging in addition to conventional transmission and fluorescence imaging. We evaluated the scanner for confocal image quality, stability, accuracy, linearity and sensitivity. The point spread function of the confocal image was asymmetric, but spatially invariant; therefore, we have implemented a deconvolution algorithm for the instrument. The stability and relocalization inaccuracy in the X-Y dimensions were well below the resolution limit. The intensity response was linear (R² ≥0.9996). Calibrated measurements showed that ≥ 2000 molecules per cell could be reliably detected and mapped using indirect labeling. We found that the microscope illumination is asymmetric and inhomogeneous. To overcome this, we introduced a correction method that is suitable for the proper correction of images also from small areas as well as spatially diverse samples and gives reliable results for quantitative measurements. Based on this and findings on instrument precision, the Pannoramic Confocal appears suitable for measuring molecular interactions in histological sections. Förster resonance energy transfer (FRET) is a popular tool for studying molecular interactions due to its high distance sensitivity in the 1-10 nm range. The intensity-based, spectrally corrected FRET measurement method has the advantage of being suitable for three-dimensional as well as time-lapse measurements. To use this method in microscopy with pixel-by-pixel autofluorescence correction, the flow cytometric cell-by-cell autofluorescence correction algorithm has been adapted. The implementation of pixelwise autofluorescence correction improves the accuracy of measurements and is particularly recommended for samples with low signal/autofluorescence ratios and spatially variable autofluorescence intensities. The Fiji/ImageJ plugin written to perform the analysis is freely available. The measurement procedure was also tested with the Pannoramic Confocal, where FRET efficiencies measured on cells and tissue cryosections were in accordance with those measured as control with an LSM 880 laser scanning microscope. Based on this, the pixel-by-pixel autofluorescence corrected FRET measurements have been implemented in the Pannoramic Confocal digital pathology scanner software, providing the methodological and instrumental basis for diagnostic FRET measurements.80hudigitális patológiadigital pathologyFörster rezonancia energia transzferFörster resonance energy transferautofluoreszcencia korrekcióautofluorescence correctionGyógyszertudományokOrvostudományok