Nagy, PéterDitrói, Tamás2023-11-102023-11-102023https://hdl.handle.net/2437/360490A munka során hidrogén-szulfid vérben történő detektálására dolgoztunk ki olyan monobromobimánt alkalmazó módszert, amellyel az eddigieknél pontosabban és megbízhatóbban elvégezhető az analízis. Az előkészítés környezeti változóit egyenként vizsgálva meghatároztuk, hogy mely paraméterek milyen mértékben vannak hatással a végeredményre, amiből azt is megállapítottuk, hogy a jelenleg irodalomban megjelent metodikai leírások nem elégségesek a kísérleti eredmények pontos reprodukálásához. Az irodalomban fellelhető módszerek összehasonlításával bemutattuk, hogy ezek az effektusok valóban felelősek lehetnek a publikált adatok közötti jelentős, akár nagyságrendi eltérésekért. Megállapítottuk, hogy ennek a bizonytalanságnak az oka vérben lévő kötött szulfid-tartalékokból való lassú, dinamikus egyensúlyon keresztül történő, alkilálás hatására bekövetkező hidrogén-szulfid felszabadulása. A paraméter-függések vizsgálatának eredményeire alapozva egy olyan módszert állítottunk össze és validáltunk, amellyel megbízható, reprodukálható eredményeket kaphatunk vérminták analízise során, valamint biztosíthatjuk összehasonlíthatóságukat. Az eljárás validálásához megmutattuk, hogy a módszerrel nyert eredmények az eddig publikált módszereknél jobban reprodukálhatóak, valamint igazoltuk, hogy a fagyasztás/olvasztás folyamata nem befolyásolja a mért szulfid szinteket. A klinikai alkalmazhatóság validálásához több betegmintát is rendelkezésünkre bocsátottak együttműködő partnereink. Ezek közül a legfontosabbak az etilmalonsav enkefalopátiás betegek plazmái voltak, amelyeknél nagyon jelentős vérbeli szulfid növekedést tudtunk detektálni a vártak szerint. Emellett egy kísérleti fázisban lévő szulfid-donor tulajdonsággal rendelkező gyógyszer esetén is meg tudtuk mutatni, hogy a kezelt betegek vérében a mérhető hidrogén-szulfid szint kis mértékben, ám szignifikánsan megnőtt, igazolva módszerünk és egyben a hatóanyag alkalmasságát is. A módszert felhasználtuk örökletes, kén-metabolizmust érintő ritka betegségek vizsgálatára is. A kezdetben felállított hipotézisünket megcáfoltuk, miszerint a kén-hidrogén termelésében érintett enzimútvonalak sérülése mérhető változást okoz a vérbeli kén-hidrogén koncentrációban. Ennek vélhető magyarázata a katabolikus útvonalak fokozott jelentősége a szintézissel szemben, amelyet a CBS enzim aktivitásának és a mért H2S szintek korrelációjának hiányában már korábban is feltételeztünk.The main objective of the work presented here was to establish a new method for the measurement of hydrogen sulfide in blood samples that is more reliable and reproducible than the ones that are already published. Exact parameters of the sample preparation procedure were systematically studied to assess their effects on the actual measured H2S concentration. This study shed light on multiple shortcomings of the previously published methods, like the inaccurate description of the temperature used during the alkylation step, which was shown to have an extreme effect on the results. Comparing published methods, we have shown, that these inaccuracies together with the different parameters used during sample preparation can be behind the observed large discrepancies in measured blood H2S levels. The primary reason identified behind these findings was the fact, that this method does not actually measure the so-called free sulfide levels (H2S and HS-). This can be attributed to the blood sulfide-pool that is in dynamic equilibrium with free sulfide levels, constantly and slowly releasing it as it is consumed by the alkylation agent monobromobimane. Based on our findings, we have chosen a certain parameter set and developed and validated a method for blood H2S determination that is reliable and reproducible, ensuring that results produced will be comparable unlike before. We have shown that the reproducibility exceeds those of previous methods and that freezing/thawing does not affect the results, therefore sera/plasma can be collected and analyzed later. To validate its usability in clinical studies, multiple human samples were provided by our collaborators and assayed using the new method. We had a chance to analyze blood samples from patients suffering from ethylmalonic encephalopathy, where the expected high sulfide levels were unambiguously proven by our method. We were also given a chance to receive blood samples from a Phase 2 study of an NSAID that has a sulfide-donor property. Treated patient blood samples showed a slight but significant increased sulfide level versus the control group proving that the drug has the expected effect and our method is capable of distinguishing such small differences. The method was also used on samples obtained from patients with rare genetic diseases affecting sulfur metabolism. Our initial hypothesis, that defects in enzymes responsible for H2S production would translate into changes in bioavailable blood sulfide levels, was however disproved by our measurements. This can be attributed to the more pronounced influence of the catabolic enzymes on H2S levels as we have seen it in the case of ethylmalonic encephalopathy.99huHidrogén-szulfid, kromatográfia, analitikai kémia, vér, laboratóriumi diagnosztika, módszerfejlesztésHydrogen sulfide, chromatography, analytical chemistry, blood, laboratory diagnostics, method developmentElméleti orvostudományokOrvostudományok