Almássy, JánosDiszházi, Gyula2022-06-082022-06-082022http://hdl.handle.net/2437/334350A kutatásom során enzimatikus emésztéssel izolált könny- és hasnyálmirigy acinus sejteken vizsgáltam különböző ioncsatornák szerepét, plazma membránban való elhelyezkedését és működésbeli összefüggéseiket az intracelluláris Ca2+-koncentrációval [Ca2+]i. Az elsődleges könnyszekrétum kiválasztása az egyrétegű epitél sejtrétegen, egyirányba transzportált vízen és ionokon alapszik. Ez a mechanizmus mind a transzporterek, mind az intracelluláris Ca2+-jel aszimmetrikus apiko-bazális eloszlását követeli meg. Az egér könnymirigy acinus sejtekben a Ca2+-függő ioncsatornák azonosítása és lokalizálása volt a fő célunk. Az eredményeink azt mutatják, hogy a Ca2+-függő K+-áram paxillin érzékeny, elhelyezkedése apikálisan kifejezett, bazálisan elhanyagolható, és a Ca2+-függő Cl--árammal azonos membránkompartmentben helyezkedik el. Mindebből feltételezhető, hogy a K+ és a Cl- is az acinuslumenbe szekretálódik, amely magyarázatot ad a primer szekrétum magas luminális Cl- koncentrációjára (∼141 mM), de ellentmond az alacsony K+-koncentrációnak (<17 mM). Az előzőekből következik, hogy a K+ valamilyen mechanizmussal visszajut az acinus sejtbe az elsődleges könnyszekrétumból, ezért feltételeztük a Na+-K+ pumpa jelenlétét a plazma membrán apikális részén. A hipotézist specifikus Na+-K+-pumpa antitest alkalmazásával végzett immunfestéssel ellenőriztük, és igazolást nyert, hogy a bazális mellett az apikális oldalon is található Na+-K+ pumpa a könnymirigy acinus sejten. Eredményeink alapján egy új könnyszekréciós modellt javaslunk, melyben a paracelluláris Na+-transzport kiegészül egy transzcelluláris útvonallal, az ehhez szükséges hajtóerőt pedig a Na+-K+-pumpa biztosítja. Az elsődleges hasnyálmirigy-szekrétum kiválasztásában jelentős szerepe van a hasnyálmirigy acinus sejt [Ca2+]i-jának, ezért célunk az acinus sejtek Ca2+-függő ioncsatornáinak feltérképezése, szerepük tisztázása volt. A QPCR tesztünk alapján nagy expressziót mutatott a TRPM4 csatorna a mirigyben, ezért kísérleteink során az egér hasnyálmirigy acinus sejtekben vizsgáltuk ezen csatorna szerepét. A TRPM4 csatorna egy Ca2+-aktivált nem szelektív monovalens kation csatorna, ezért feltételeztük, hogy a szekretagóg stimulus hatására megemelkedő [Ca2+]i aktiválja azt, és a rajta keresztül a sejtbe áramló kationok depolarizálják a sejtet, a Ca2+ hajtóereje lecsökken, így alacsonyabb lesz a beáramló Ca2+ mennyisége. Kísérleteink során patch-clamp módszerrel igazoltuk, hogy egér hasnyálmirigy acinus sejten található Ca2+-aktivált Na+-áram, amely a TRPM4 gátlószereivel (CBA, 9-Phenanthrol) gátolható volt. Továbbá áram-clamp körülmények között igazoltuk, hogy a Ca2+-függő Na+-áram a sejtmembrán átlagos ∼17 mV-os depolariációját okozza, amely szintén gátolható volt CBA-val. Annak érdekében, hogy tesztelhessük a depolrizáció hatását a Ca2+-beáramlásra, [Ca2+]i méréseket végeztünk, amelyek alapján megállapítható, hogy a Ca2+ beáramlás meredeksége TRPM4 génkiütött és CBA-val kezelt acinus sejteken magasabb a kontrollhoz képest, míg a TRPM4 génkiütött sejteken a Ca2+ beáramlásából származó intracelluláris Ca2+-jel amplitudója is emelkedett. Az eredményeink alapján igazolást nyert a hipotézisünk, miszerint a TRPM4 aktivációja csökkenti a Ca2+-beáramlás hajtóerejét a plazmamembránon keresztül.In my research, I investigated the role of different ion channels, their location in the plasma membrane and their functional relationships with intracellular Ca2+-concentration [Ca2+]i on tear and pancreatic acinar cells isolated by enzymatic digestion. The primary tear secretion is a unidirectional water and ion transportation of the monolayer epithelial cells. This mechanism requires asymmetric apico-basal distribution of both the transporters and the intracellular Ca2+-signal. Our main goal was to identify and localize Ca2+-dependent ion channels in murine lacrimal acinar cells. Our results show a paxillin sensitive Ca2+-dependent K+-current, which mainly located apically and negligible in the basal region, and it is located in the same membrane compartment as the Ca2+-dependent Cl--current. All of this proposes that both K+ and Cl- are secreted into the acinar lumen, which explains the high luminal Cl- concentration in the primary secretion (∼141 mM), but contradicts the low K+ concentration (<17 mM), suggesting that K+ returns to the acinar cell from the primary tear secretion by some mechanism, that’s why we hypothize the presence of a Na+-K+ pump in the apical part of the plasma membrane. The hypothesis was verified by immunostaining using a specific Na+-K+ pump antibody, and it was confirmed that the Na+-K+ pump located on both the apical and on the basal side of the lacrimal acinar cell. Based on our results, we propose a new tear secretion model in which paracellular Na+-transport is complemented by a transcellular pathway driven by the Na+-K+ pump. The intracellular Ca2+-concentration of the pancreatic acinar cell plays a significant role in the secretion of the primary pancreatic juice, so we aimed to find previously unknown Ca2+-dependent ion channels. Based on our QPCR test, the TRPM4 channel showed high expression in the gland, so in our experiments we examined the role of this channel in murine pancreatic acinar cells. Since the TRPM4 channel is a Ca2+-activated non-selective monovalent cation channel, we hypothesized that after intracellular Ca2+-concentration increases under the influence of a secretagogue stimulus, cations flowing into the cell through the TRPM4 channel depolarize the cell, thus reducing the driving force of Ca2+. In our experiments, we demonstrated by patch-clamp that a Ca2+-activated Na + current is present in murine pancreatic acinar cells, which can be inhibited by TRPM4 inhibitors (CBA, 9-Phenanthrol). Furthermore, under current-clamp conditions, we demonstrated that the Ca2+-dependent Na+-current causes an average ∼17 mV depolarization of the cell membrane, which could be inhibited by CBA. In order to test the effect of depolarization on Ca2+-influx, [Ca2+]i measurements were performed, which showed that the slope of Ca2+-influx is higher in TRPM4 knockout and CBA-treated acinar cells compared to control, while in TRPM4 knockout cells the amplitude of store operated Ca2+-entry (SOCE) also increased. Based on our results, our hypothesis that TRPM4 activation reduces the driving force of Ca2+-influx across the plasma membrane was confirmed.101huhasnyálmirigykönnymirigyfolyadékszekrécióacinus sejtBK csatornaNa+-K+ pumpaTMEM16ATRPM4hasnyálmirigySOCEpatch-clamplacrimal glandfluid secretionacinar cellBK channelNa+-K+ pumppancreasElméleti orvostudományokOrvostudományok