Az aktin-citoszkeleton, ezen belül az aktin-miozin kölcsönhatás szerkezeti változásai az endothel sejtek alakjának és barrier funkciójának fontos tényezője. Gyulladásos folyamatokban, pl. trombin hatására, az endotél sejtek kontrakciója következik be, a sejtek között rések jönnek létre, a barrier funkció sérül. A kontrakció hátterében a miozin 20 kDa könnyűláncának (MLC20) foszforilációja áll, amelynek foszforilációját a MLC-kináz (MLCK), míg defoszforilációját a protein foszfatáz-1 (PP1) típusú miozin foszfatáz (MP) katalizálja. A MP holoenzimben található MYPT1 regulátor alegység a PP1 katalitikus alegység (PP1c) szubsztrátspecificitását és aktivitását is szabályozza, mivel a MYPT1 Rho-kináz (ROK) által történő foszforilációja a Thr696 és Thr853 oldalláncokon gátolja a PP1c aktivitást. A foszfo-MYPT1 defoszforilációjának mechanizmusa azonban, különösen endotél sejtekben, nem ismert. Tanulmányoztuk a Ca2+/CaM-függő Ser/Thr specifikus protein foszfatáz (CN vagy PP2B), szerepét humán és emlős endotél sejtek (BPAEC és HPAEC) aktin-citoszkeleton szerkezetének szabályozásában, ill. a MYPT1 MP gátlást okozó foszforilációs helyeinek defoszforilációjában. Kimutattuk, hogy a CN gátlószer CsA jelenlétében a trombin hatására az EC-k között kialakuló rések hosszabb ideig megmaradnak, míg ezzel szemben a konstitutiv aktív CN (ΔCNA-pEGFP) overexpressziója elősegíti a trombin-indukált stressz-kábelek mennyiségének csökkenését BPAEC-ben. CsA kezelést követően növekedett az intracelluláris Ca2+ ([Ca2+]i) szintje, valamint a kofilinSer3 és a MYPT1Thr696 foszforilációja [Ca2+]i és ROK-függő módon. A tisztított CN defoszforilálta a 32P-MYPT1-et, valamint az aktív CN fragmentum overexpressziója az endogén MYPT1pThr696 szintjének csökkenését okozta tsA201 sejtekben, a CN közvetlen szerepére utalva a foszfo-MYPT1 defoszforilációjában. BPAEC CsA-val és trombinnal történő kezelése részlegesen fenntartott MYPTpThr696 és MLC20pSer19 szintet, valamint hosszabb ideig fennmaradó trombin-indukált transzendotéliális ellenállás csökkenést (EC diszfunkciót) eredményezett. Igazoltuk a CN és a MYPT1 kölcsönhatását BPAEC- és HPAEC-ben, valamint in vitro kötődési módszerekkel feltártuk e kölcsönhatás szerkezeti hátterét is. A CN kötődése a teljes és rövidített rekombináns MYPT1 fragmentumokhoz arra utalt, hogy a CN a MYPT1 N-terminális régiójához kötődik, amelyben megtalálható a CN szubsztrátkötő PIXIT-szerű szekvencia (300PLIEST305) motívum is. Összefoglalva: a CN-t a MP aktivitását szabályozó enzimként azonosítottuk és kimutattuk szerepét az EC barrier integritás szabályozásában. A stabil CN-MYPT1 komplex kialakulása azt sejteti, hogy ezen enzimek kölcsönhatásának további fiziológiai funkciói is lehetségesek. Changes in actin-cytoskeleton and in the actin-myosin interaction are important determinants of the shape and barrier function of endothelial cells (EC). Inflammation (evoked by thrombin for example) causes contraction of EC, which results in intercellular gap formation and barrier dysfunction. Contraction of the cells is induced by the phosphorylation of the 20 kDa light chain of myosin (MLC20), which is phosphorylated by the MLC kinase (MLCK), while the dephosphorylation is catalyzed by myosin phosphatase (MP), a protein phosphatase-1 (PP1) holoenzyme. The myosin phosphatase targeting subunit (MYPT1) binds to and regulates the substrate specificity and activity of PP1 catalytic subunit (PP1c), since its phosphorylation on the Thr696 and Thr853 side chains by Rho-kinase (ROK) causes the inhibition of PP1c. On the other hand, mechanism of dephosphorylation of phospho-MYPT1, especially in EC, is not known yet. We studied the role of the Ca2+/CaM-dependent Ser/Thr-specific protein phosphatase (CN, or also known as PP2B) in the regulation of the actin-cytoskeleton structure of human and bovine EC (HPAEC and BPAEC) and its involvement in the dephophorylation of phospho-MYPT1 at the MP inhibitory sites. We observed that CsA, an inhibitor of CN, prolongs the recovery of EC from thrombin-induced gap formation, whereas overexpression of a constitutively active CNA (ΔCNA-pEGFP) resulted in reduced thrombin-induced stress fiber formation in BPAEC. CsA treatment induced a rise in intracellular Ca2+ level and increased the phosphorylation level of cofilinSer3 and MYPT1Thr696 in a Ca2+- and ROK-dependent manner. Purified CN dephosphorylated the 32P-labeled MYPT1, while the overexpression of an active catalytic fragment of CN in tsA201 cells decreased the amount of endogenous MYPT1pThr696 suggesting a direct role of CN in the dephosphorylation of phospho-MYPT1. Treatment of BPAEC with CsA before the addition of thrombin resulted in partially maintained phosphorylation level of both MYPT1pThr696 and MLC20pSer19, and slowed down the recovery of transendothelial electrical resistance from the thrombin induced decrease. Interaction of MYPT1 with CN was verified in both BPAEC and HPAEC. Structural analysis of the interaction revealed binding of CN to the full-length and truncated mutants of MYPT1 with CN binding sites localized at the N-terminal half of MYPT1 in accordance with the presence of a putative CN-binding PxIxIT motif (300PLIEST305) in MYPT1. In summary, we identified the role CN in the regulation of myosin phosphatase activity and the control of EC barrier integrity. Formation of a stable CN-MYPT1 complex suggests that the interaction of the two enzymes may have broader physiological significance.