During my thesis work I had the opportunity to study retroviral proteases (HIV-1, HIV-2, EIAV, AMV, MMLV, MMPV, MMTV, BLV, HLTV-1, WDSV and HFV) and to compare their substrate specificity. HFV PR showed a low catalytic activity on type 1 substrates; just one peptide was cleaved (P3 Val). We have characterized some foamy PR mutants by constructing them based on the conserved amino acids in HIV-1 PR sequence at the same positions. Mutations were made in the vicinity of the catalytic aspartates of HFV PR. We built a molecular model for HFV PR. The mutations in HFV PR resulted in wild-type-like or even higher pH optimum. Similar results were found for stability against urea at both pH values studied (6.0 and 7.2). HFV PR showed not to be as sensitive towards mutations as other retroviral proteases, especially HIV-1 PR. Our mutational results suggest that requirements of FV PR structure may differ from that of other retroviral protease structures. It is possible that during evolution FV PR did not evolve to maximize the dimerization energy, as compared with HIV-1 PR. Knowing better the spumavirus enzymes and their replication strategy will help in the development and application of retroviral vectors (based on this non-pathogenic virus) in gene therapy. We have examined the ability of 34 oligopeptides with single amino acid substitutions in the P1, P3, and P4 positions of the HIV-1 Gag cleavage site (MA/CA: Val-Ser-Gln-Asn-Tyr↓Pro-Ile-Val-Gln) to support cleavage by the mentioned retroviral PRs. The specificity of proteases of eleven retroviruses representing each of the seven genera of Retroviridae was studied using a series of oligopeptides. This system allowed us to examine the relative rates of cleavage under typical conditions (which include the low pH and high salt concentration) used to detect the cleavage of peptides. Molecular models for all studied proteases were built, and they were used to understand the specificity similarities and differences between retroviral proteases and for interpretation of the results. We have classified the processing sites into groups defined by the size and nature of the preferred amino acid residues at the P1, P3, and P4 positions. Because many of the mutations occurring in drug resistance (in the therapy against AIDS) produce residues that can be found in other retroviral proteases we tried to find an agreement between the amino acid preferences in a given position and their naturally occurring type 1 cleavage sites sequences. The specificity distinctions of the proteases correlated well with the phylogenetic tree of retroviruses prepared solely based on the PR sequences. Comparative study of retroviral proteases is expected to contribute to our understanding of the general and specific features of the PR, and to help to discover the mutational capacity of the HIV-1 PR. Knowledge of the substrate specificity of a variety of retroviral proteases constitutes an essential step toward the rational design of a broad spectrum inhibitors, from which multiple viral strains and even different retroviruses can not escape by mutations.

Munkám során lehetőségem volt a retrovirális proteázokat (HIV-1, HIV-2, EIAV, AMV, MMLV, MMPV, MMTV, BLV, HLTV-1, WDSV és HFV) tanulmányozni és szubsztrátspecificitásúkat összehasonlítani. A HFV proteáz igencsak alacsony katalitikus aktivitást mutatott az 1-es típusú szubsztrátokon; csak egyetlen egy szubsztrát volt hasítható (P3 Val). Tanulmányoztunk pár foamy PR mutánst megvizsgálván a HIV-1 PR felé mutató mutációk hatását, szerkezetileg azonos pozíciókban. Jellemeztük a mutációk hatását a katalitikus aszpartát közelében és az eredményeket összevetettük a HIV-1 PR-zéval. Felépítettük a HFV PR molekuláris modelljét. A HFV PR mutációi vad-típusúhoz hasonló eredményekhez vezetett, vagy még magasabb pH optimumhoz. Hasonló eredményeket kaptunk a dimer stabilitás tanulmányozásában is, mindkét vizsgált pH-értéken (6.0 és 7.2). A HFV PR jobban tolerálja a mutációkat a katalitikus aszpartáthoz közeli helyeken, mint más retrovirális proteáz (pld. HIV-1 PR). A mutációs vizsgálataink azt sugallják, hogy a foamy PR szerkezete eltér a többi retrovirális enzimétől. Lehet, hogy az evolució során a foamy enzim dimerizációs energiái nem optimalizálódtak úgy, mint a HIV-1 PR esetében. Jobban ismerve a spumavírus enzimjeit és a replikációs strategiáját segít majd a foamy vektorok tervezésében és alkalmazásában, mint lehetséges génterápia eszköz a betegségek orvoslásában. Megvizsgáltuk a retrovirális proteázok hasítását, amely vizsgálathoz 34 különböző szubsztrátot használtunk. Az oligopeptidek a P1, P3, és P4 pozíciókban tartalmaztak különböző aminosav cserét, a HIV-1 Gag hasítási helyen (MA↓CA: Val-Ser-Gln-Asn-Tyr↓Pro-Ile-Val-Gln). A tizenegy retrovirális proteáz specificitását vizsgáltuk, a Retroviridae család mind a hét nemzetsége képviseletével, egy sor oligopeptid szubsztrát felhasználásával. A rendszer lehetővé tette számunkra, hogy vizsgáljuk meg a hasítás relatív (aktivitás értékek) arányait a peptidek hasíthatóságának kimutatására, ugyanazon feltételek mellett (amelyek magukban foglalják az alacsony pH és magas só koncentrációt). A vizsgált fehérjebontó enzimeknek a molekuláris modellezése fontos eszköz, hogy megértsük a specificitásúk közötti hasonlóságokat és különbségeket. A hasítási helyeket csoportokba osztottuk (vírus csoportok különültek el) az aminosav (-kedvezményezettség alapján) mérete és jellege által (a P1, P3, és P4 pozíciókban). A HIV-1 proteázokban rezisztencia kialakulása során (az AIDS-elleni terápiában) a létrejövő mutációk számos esetben olyan aminosavak megjelenését mutatja, amelyek megfelelnek más retrovirális proteázokban hasonló helyen található aminosavrészeknek, ezért kerestünk egy kötődést az aminosav-preferencia egy adott pozícióban és a vizsgált proteázok természetben előforduló 1-es típusú hasítási hely szekvenciái között. A proteázok specificitásbeli különbségek jól korreláltak a retrovírusok filogenetikai fájával, melyek jól követik a proteáz-szekvencia illesztés alapján felépített törzsfa menetét, de nem esnek annak csoportjaival pontosan egybe. A retrovirális proteázok összehasonlító tanulmánya remélhetőleg hozzájárul a proteinázok általános és speciális jellemzői megértésében, és segítséget nyújthat a HIV-1 PR mutációs képességének feltérképezésében. Fő hipotézisünk az volt, hogy a vizsgált retrovírusok enzimjei evolúciósan szelektált életképes variációknak tekinthetőek. Specificitásuk jellemzése rávilágíthat a retrovirális proteinázok alapvető jellegzetességeire, ami elősegítheti olyan széles spektrumú inhibitorok tervezését, amelyek elől a vírusok nem képesek kitérni különböző mutációk által.