Biológiai jelentőségű vegyületek modern tömegspektrometriai vizsgálata

Absztrakt

Az ESI körülmények között képződő protonált buprenorfin származékok MS/MS vizsgálatát végeztük el Q-TOF tömegspektrométerrel. A fragmentáció a nitrogénen lévő szubsztituens lehasadásával kezdődik, amely a piperidin gyűrű egy részével együtt távozik az prekurzorionról. Ezzel párhuzamosan a C(6) szénatomon lévő metoxi csoport is lehasad metanolként, valamint a C(7) szénatomon lévő csoport fragmentációja is elindul, kis molekulák kilépésével. Meghatároztuk az MS/MS spektrumban megjelenő fragmensionok letörési görbéit, amelyek az alkalmazott ütközési energia függvényében mutatják a termékion intenzitását. A disszociáció energiafüggésének vizsgálatakor megállapítottuk, hogy azon származékok, ahol a C(7) szénatomon acetil csoport található nagyobb ütközési energiánál fragmentálódnak, mint azok a származékok, ahol a C(7) szánatomon –C(CH3)(tBu)OH vagy – C(CH3)(Pr)OH csoportok vannak. Mivel a nitrogénen és a C(7) szénatomon lévő szubsztituensek már kis ütközési energiánál lehasadnak, a további fragmentáció mind az öt vizsgált vegyület esetében egy közös termékionból vezethető tovább. Az ütközési energia növelésével megindul a kondenzált gyűrűs alapváz fragmentációja és számos új fragmension jelenik meg. Javaslatot tettünk a legtöbb képződött termékion szerkezetére és a képződésükhöz vezető reakcióutakra. Javaslataink összhangban vannak a pontos tömeg alapján meghatározott összegképlettel és a prekurzorion szerkezetével. Pszeudo MS3 mérésekkel igazoltuk az MS/MS eredményekből feltételezett fragmentációs útvonalakat. A buprenorfin fragmentációs viselkedését más morfinszármazékok fragmentációjával összehasonlítva megállapítottuk, hogy sok fragmension közös, a különbségeket a C(18)-C(19) etilén hídból eredő eltérő viselkedés eredményezi. Javaslatot tettünk azon termékionok képződésének mechanizmusára, amelyeknél ennek az etilén hídnak szerepe van. Megvizsgáltuk a szilimarin komponensekből ESI körülmények között keletkezett, egyszeresen negatív töltésű deprotonált ionok fragmentációjának energiafüggését. Meghatároztuk a szilimarin komponensek fragmentációjának mértékét, a disszociálatlan hányad (SY) értékeket minden ütközési energiánál. Az SY értékeket az ütközési energia függvényében ábrázolva megkaptuk a SY görbéket, amelyekből megállapítottuk, hogy a szilikrisztin A és B fragmentációja 5 eV-tal kisebb energiánál játszódik le, mint a többi komponens esetében. A görbék alapján meghatároztuk az egyes vegyületekhez tartozó CE50 értékeket, vagyis azt az ütközési energiát, ahol az prekurzorion 50%-ban fragmentálódott. A szilibin A és az izoszilibin A fragmentációs viselkedése a két vegyület nagyfokú szerkezeti hasonlósága ellenére eltér egymástól. A szilibin A-ból nagyobb intenzitással keletkezik a 301 m/z ion, az izoszilibin A-ból pedig a 453 m/z ion. A 451 m/z ion pedig csak a szilibin A MS/MS spektrumában van jelen, az izoszilibin A spektrumából teljesen hiányzik. A megfigyelt különbségeket a másodlagos konformerek eltérő stabilitásával magyaráztuk. A legstabilabb konformerben mindkét vegyület esetén a C és a D gyűrű csavartkád állású és a rajtuk lévő szubsztituensek ekvatoriális helyzetűek. A szilibin és az izoszilibin azon konfermerei, ahol egyszerre mindkét gyűrűn lévő szubsztituensek axiális helyzetűek eltérő stabilitást mutatnak, ez okozhatja a fragmensionok intenzitásának eltérését. A szintetizált poli-(2-etil-2-oxazolin) polimer karakterizálása után különböző lágyionizációs technikákkal (ESI, APCI, DART) tanulmányoztuk a fragmentációs viselkedését. Megmutattuk, hogy a szintézis során kétféle láncvégű polimer keletkezik a H-pEtOx (hidrogén és hidroxil végcsoportú) és a Me-pEtOx (metil és hidroxil végcsoportú polimer). Meghatároztuk a számátlag- valamint tömegátlag-molekulatömegeket és a polidiszperzitást méretkizárásos kramatográfiával és tömegspektrometriás módszerekkel. Összehasonlítva a kapott ereményeket megállapítottuk, hogy APCI-MS módszerrel meghatározott átlag molekulatömege a vártnál kisebb, mivel a nagyobb tömegű molekulák már a magas hőmérsékletű ionforrásban fragmentálódnak. Az egyszeres pozitív töltésű protonált oligomerek fragmentációját mindkét végcsoportú polimer esetén megvizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy az egyes prekurzorionok MS/MS spektrumában 3 sorozat van jelen. A mért pontos tömegek alapján megállapítottuk ezen sorozatok összegképletét. Pszeudo MS3 mérésekkel részletesen vizsgáltuk a fragmentációs útvonakat, és mechanizmust javasoltunk a fragmension sorozatok képződésére. Deuterált oldószerben végzett MS/MS vizsgálatokkal sikeresen igazoltuk a javasolt szerkezeteket és fragmentációs utakat. A fragmentáció hatásfokát disszociálatlan hányad (SY) görbék segítségével jellemeztük. Meghatároztuk a különböző polimerizációs fokú polimerek fragmentációjára jellemző CE50 ütközési energiákat. Megállapítottuk, hogy lineáris összefüggés van a monomer egységek száma és a CE50 értékek között.

The collision induced dissociation of the buprenorphine and four related compounds was studied with ESI-QTOF mass spectrometry. The generalized fragmentation scheme of the studied compounds starts with the elimination of the R2 substituent from the piperidine nitrogen and the subsequent rupture of the piperidine ring. This process is parallel with the losses of small molecules from the R1 substituent at C(7) and the methoxy substituent at C(6). Based on the energy-dependent CID experiments the R1 = acetyl group shows higher stability towards dissociation, although no new routes of fragmentation were observed when R1 is acetyl. In the last stage of fragmentation the core-ring structure is altered during the multistep rearrangement and cross-ring cleavage processes. The −OR3 substituent at C(3) is eliminated only during these steps. The overall fragmentation pattern of buprenorphine (5) shows several similarities to that of the related morphinans, the main differences are due to the presence of the C(18)-C(19) ethylene bridge in buprenorphine. The energy-dependent fragmentation profile of a selected precursor or fragment could be easily visualized by the construction of two-dimensional plots from the recorded mass spectra. The collision energy dependence of the fragmentation behavior of the major silymarin constituents was studied by electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. The survival yield (SY) plots of silydianin, the silybins and the isosilybins coincide with each other, while the SY plots of the silychristins are shifted to lower energies with about 5 eV. As the breakdown diagram analysis revealed it is advisable to record the MS/MS spectra of the components at adjusted laboratory frame collision energies to get the same SY value (e.g., 50%) in each case, as this technique ensures higher reproducibility, thus can be utilized for the rapid identification of the silymarin constituents. We also highlighted and explained that a simple substituent exchange can dramatically alter the fragmentation properties as in the case of silybin A and isosilybin A, where the distict fragmentation behavior is due to a stability shift between the possible conformations. The results of the conformational analysis show that the double diaxial conformer of silybin A has significantly lower relative energy compared to the analogous conformer of isosilybin A. The synthesized poly(2-ethyl-2-oxazoline) polymer was characterized by SEC, MALDI-TOF MS and Q-TOF MS equipped with ESI, APCI, DART ion sources. Two different polymer series appeared in the mass spectra because of chain transfer reactions during the polymerization (one with hydrogen and hydroxyl end-groups, and the other with methyl and hydroxyl end-groups). The average molecular weights and polydispersity were compared after determination by SEC, MALDI-, APCI- and ESI-MS. The fragmentation behaviour of the protonated oligomers was studied in the quadrupole-time of flight mass spectrometer (Q-TOF MS) with electrospray (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI) and direct analysis in real time (DART) soft ionization techniques. Three product ion series formed from the precursor ion were identified, and a mechanism was proposed for the dissociation, based on the accurate mass of the product ions, pseudo MS3 experiments and the energy-dependence of the product ion intensity. Two additional losses were observed in the MS spectra, the elimination of a side group and elimination of propionic acid within the chain. The results of the MS/MS experiments of the polymer dissolved in deuterated methanol confirmed the proposed mechanisms. The survival yield method was used to describe the efficiency of the fragmentation quantitatively; and it was studied as a function of chain length of the pEtOx oligomer and the ionization method. Linear correlation was established between the number of the repeat units of the oligomers and the laboratory frame collision energy. This simple relationship enables the prediction of proper laboratory frame collision energy to obtain structural information for polymers.

Leírás
Kulcsszavak
tömegspektrometria, mass spectrometry, fragmentáció, buprenorfin, szilimarin, poli-(2-etil-2-oxazolin), fragmentation, buprenorphine, silymarin, poly-(2-ethyl-2-oxazoline)
Forrás