A kis dózisú aszpirin terápia napjainkban is széles körben alkalmazott az akut artériás aterotrombótikus események megelőzésében. Az aszpirin a ciklooxigenáz-1 enzim 529-es szerin reziduumát irreverzibilisen acetilálja, ezáltal gátolt a trombocita tromboxán A2 képzés arachidonsavból. Az aszpirin hatás követésére jelenleg alkalmazott rutin laboratóriumi tesztek változó eredményeket adnak, melyek pontos értékelésére referencia módszerrel való összehasonlítás vált szükségessé. Bizonyos esetekben az aszpirin nem előzi meg az akut vaszkuláris eseményeket, ill. egyes laboratóriumi módszerek inkonzekvensen mutatták ki az aszpirin hatását, ezért bevezetésre került az "aszpirin rezisztencia" fogalma, melyre nem született pontos, általánosan elfogadott definíció, megnehezítve az eredmények értelmezését és a terápiás javaslatok kialakítását. Két új referencia módszert fejlesztettünk ki az aszpirin által előidézett ciklooxigenáz-1 acetiláció közvetlen és közvetett kimutatására. Az első közvetlen módszer működési elve monoklonális anti-humán ciklooxigenáz-1 ellenes antitestek alkalmazása, melyek csak az acetilált (inaktivált) ciklooxigenáz-1-el vagy csak az aktív (nem acetilált) ciklooxigenáz-1-el adnak reakciót. Az antitesteket a humán ciklooxigenáz-1 525-533 reziduumok aminosav szekvenciájának megfelelő acetilált és nem acetilált nonapeptidek ellen termeltettük. Western blotting technikával az antitestek egyértelműen különítették el az acetilált- és nem acetilált enzimet trombocita lizátumban. A második módszer arachidonsav indukciót követően trombociták által képzett tromboxán A2 inaktív, stabil metabolitjának, a tromboxán B2-nek a mennyiségét méri trombocita dús plazmában. Ez a módszer a trombociták tromboxán B2 képző kapacitását határozza meg és közvetetten jelzi az aszpirin által előidézett ciklooxigenáz-1 gátlást. A két referencia módszerrel 108 kis dózisú aszpirint szedő egészséges önkéntesen vizsgáltuk az aszpirin hatást. Az önkénteseket egy hétig napi egy alkalommal 100 mg enteroszolvens bevonatos aszpirinnel kezeltük. A vérmintákat az első aszpirin bevétele előtt, azt követően 24 órával ill. 168 órával nyertük (0. napos, 1. napos és 7. napos minták). Az aszpirin kezelés elkezdését követő 7. napon nyert valamennyi mintában a trombocita ciklooxigenáz-1 teljes acetilációját figyeltük meg, míg a kiindulási (0. napos) mintákban csak nem acetilált ciklooxigenáz-1 volt jelen. Ennek megfelelően a 7. napon a trombociták tromboxán B2 képző kapacitásának teljes gátlását tapasztaltuk, azaz a 108 önkéntes közül egy sem volt rezisztens az aszpirin hatására. A referencia módszerekkel az önkéntes csoporton kapott eredményeket párhuzamosan elvégzett, az aszpirin hatásának detektálására a klinikai gyakorlatban általánosan használt alábbi rutin módszerek eredményeivel hasonlítottuk össze: PFA-100 záródási idő meghatározása kollagén/epinefrines patronnal, VerifyNow Aspirin Assay, arachidonsav, ADP, adrenalin és kollagén agonisták által indukált trombocita aggregáció és ATP szekréció mérése lumiaggregométeren. A kezelést megelőző (kiindulási) és 7. napos eredményeket a referencia módszerekkel összehasonlítva, az arachidonsav agonistát alkalmazó tesztek (arachidonsav-indukálta trombocita aggregáció és szekréció, VerifyNow Aspirin Assay) detektálták megbízhatóan az aszpirin hatását. A további módszerek esetében jelentős átfedéseket tapasztaltunk a 0. és 7. napos értékek közt, azaz az esetek egy részében fals pozitív aszpirin rezisztenciát mutattak. Az új, általunk kidolgozott referencia módszerekkel kapott eredmények azt bizonyítják, hogy egészséges populációban a kémiai ("valós") aszpirin rezisztencia, ha egyáltalán létezik, ritkaságnak számít. Véleményünk szerint, csak az acetilált- és nem acetilált ciklooxigenáz-1-et egyértelműen elkülönítő referencia módszerek által validált arachidonsav agonistát használó módszerek alkalmasak az aszpirin trombocita gátló hatásának megítélésére.

Low dose aspirin therapy is widely used in the prevention of acute atherothrombotic complications. Aspirin (acetylsalicylic acid) irreversibly acetylates the Ser529 residue in cyclooxygenase-1 and prevents thromboxane A2 formation from arachidonic acid in platelets. 
Laboratory methods currently used to detect this antiplatelet effect of aspirin provide variable results. Comparison with reference method(s) is required to validate these routinely used methods. As aspirin is ineffective in preventing acute vascular events in some patients, and some of the routine laboratory methods give inconsequent results, the term "aspirin resistance" was introduced. This term has not been unequivocally defined creating difficulties in the interpretation of results and also in setting up recommendations for the treatment of patients.
We developed two novel reference methods that directly and indirectly assess the acetylation of platelet cyclooxygenase-1 by aspirin. The first direct method uses two monoclonal anti-human-cyclooxygenase-1 antibodies one of which only detects acetylated (inactivated) cyclooxygenase-1, while the other only reacts with active (non-acetylated) cyclooxygenase-1. The antibodies were raised against acetylated and non-acetylated nonapeptides corresponding to the amino acid sequence of human cyclooxygenase-1 525-533 residues. Using Western blotting technique the antibodies clearly distinguished between acetylated and non-acetylated cyclooxygenase-1 in platelet lysate.
The second method measures the arachidonic acid-induced formation of thromboxane B2, the inactive, stable metabolite of thromboxane A2 in vitro in platelet rich plasma. This method determines the thromboxane B2 producing capability of platelets and indirectly detects the inhibition of cyclooxygenase-1 by aspirin.
Using the aforementioned methods we analized the effect of aspirin among 108 healthy volunteers. The volunteers involved in the study received 100 mg enteric-coated aspirin daily for one week. Blood samples were collected before, 24 hours and 168 hours after the first dose of aspirin (day 0, day 1 and day 7 samples). In all samples obtained on day 7 following the initiation of aspirin treatment cyclooxygenase-1 in the platelets was fully acetylated whereas only non-acetylated cyclooxygenase-1 was present in the day 0 platelets. Further, thromboxane B2 production by day 7 of platelets was completely blocked, i.e. none of the 108 healthy individuals was resistant to the effect of aspirin.
The results obtained with the reference methods on the healthy individuals were compared to the results of the following routine laboratory tests generally used in the clinical practice for the determination of aspirin's effect: PFA-100 closure time with collagen/epinephrine cartridge, VerifyNow Aspirin Assay, platelet aggregation and ATP secretion using arachidonic acid, ADP, epinephrine and collagen as agonists.
Comparing the pre-treatment and day 7 values with the results obtained with the reference methods, laboratory tests that use arachidonic acid as platelet agonist (arachidonic acid-induced platelet aggregation/secretion and VerifyNow Aspirin Assay) showed high discriminative power. In contrast, results obtained on day 7 and day 0 by the other tests showed considerable overlap, i.e., they demonstrated false positive aspirin resistance in a part of the cases.
Our results obtained with the newly developed reference methods prove that chemical ("true") aspirin resistance, if it exists, must be a rarity among healthy individuals. In our opinion, only assays that use arachidonic acid as agonist are useful for establishing the antiplatelet effect of aspirin.