Protein foszfatázokat szabályozó biomolekuláris kölcsönhatások meghatározása felületi plazmonrezonancián alapuló kötődési vizsgálatokkal

Absztrakt

A sejtfolyamatok szabályozásának egyik fontos mechanizmusa a fehérjék reverzibilis foszforilációja, amelynek mértékét a protein kináz/foszfatáz aktivitás arány határoz meg. E folyamatokban fontos szerepe van a foszfo-Ser/Thr specifikus protein foszfatáz-1 (PP1) és -2A (PP2A) enzimeknek, amelyek katalitikus (PP1c és PP2Ac) és regulátor alegységekből állnak, szabályozásuk fontos eleme pedig kölcsönhatásuk regulátor/inhibitor fehérjékkel és toxinokkal. Ezért új inhibitorok azonosítása, azok kötődési és gátlási mechanizmusainak feltárása, valamint a fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatása a terület aktuális kutatási céljai közé tartoznak. Munkánk fő célkitűzése a felszíni plazmonrezonancián (SPR) alapuló kötődési módszer alkalmazása volt e kérdések vizsgálatában. Kimutattuk, hogy a tanninok közül az EGCG, a PGG és az Aleppói tannin hatékonyan gátolják a PP1c és PP2Ac aktivitását, a PP1c részlegesen szelektív gátlószereinek tekinthetők. SPR kompetíciós kísérletek alapján hatásukat a PP1c katalitikus centrumának hidrofób árkába kötődve fejtik ki. Foszfatázgátló inhibitor molekulák (toxinok, tanninok, ciklikus peptidek) membránpermeábilis sajátságait modelleztük szöveti eredetű lipidekből előállított micellákkal történő kölcsönhatásuk SPR módszerrel történő meghatározása alapján. Az inhibitorok membránasszociációja fiziológiás hőmérsékleten gyors, mértéke függ a lipidösszetételtől, disszociációjuk viszont lassú, feltehetően az inhibitorok lipid micellákban történő interkalációja miatt. A foszfatázgátló mikrocisztin-LR (MC-LR) biotinilált formáját, mint „befogó” molekulát alkalmaztuk PP1c és PP2Ac, valamint ezek kölcsönható fehérjéinek izolálására streptavidinnel kapcsolt szenzor chip felületén HaCaT sejtek lizátumából SPR módszerrel. A visszanyert fehérjék immunológiai elemzésével megállapítottuk, hogy a módszer alkalmas PP1c és PP2Ac, valamint kötődő fehérjéik és azok foszforilációs állapota megváltozásának detektálására kontroll, foszfatázgátlóval kezelt vagy UVA besugárzott HaCaT sejtek lizátumából. Összefoglalva, eredményeink arra utalnak, hogy a tanninok a foszfatázgátló molekulák új családjának tekinthetők és kémiai módosításukkal hatékony, kevésbé toxikus és szelektív gátlószerek fejleszthetők. A foszfatázgátló toxinok membrán lipidekkel való kölcsönhatási sajátságaik befolyásolják az inhibitorok különböző eredetű sejtekre kifejtett gátló hatását. Az SPR szenzor chip felületen immobilizált MC-LR alkalmas a foszfatáz katalitikus alegységek, valamint azok kölcsönható fehérjéinek izolálására és ezt követő immunológiai kimutatására kontroll és különböző módon kezelt sejtek lizátumából.

The reversible phosphorylation of proteins is an important mechanism in the regulation of cellular processes, which is determined by the ratio of protein kinase/phosphatase activity. The phospho-Ser/Thr specific protein phosphatase-1 (PP1) and -2A (PP2A) are responsible for the dephosphorylation of many cellular proteins. They consist of catalytic and regulatory subunit(s), and their activity is mediated by interactions with regulatory/inhibitory proteins and toxins. Identification of new inhibitors, determination of their binding and inhibitory mechanisms and detection of regulatory protein-protein interactions are included in the actual research goals of this field. Our aim was to use the surface plasmon resonance (SPR) based binding technique in the investigation of these questions. We found that tannin derivatives such as EGCG and PGG inhibit effectively the activity of PP1c and PP2Ac and they are partially selective inhibitors of PP1c exerting their inhibitory effect by binding to the substrate binding hydrophobic groove of PP1c as determined by SPR competition experiments. Membrane permeable properties of phosphatase inhibitor molecules (toxins, tannins, cyclic peptides) are modeled by their interaction to lipid micelles derived from different tissues detected by SPR method. The membrane-association of inhibitors is fast at physiological temperature and depends on the composition of the lipids, their dissociation is slow, probably due to the intercalation of the inhibitors in lipid micelles. The biotinylated form of phosphatase inhibitory microcystin-LR on the surface of streptavidin coupled sensor chip was used as capturing molecule to isolate the PP1c and PP2Ac as well as their interacting proteins from HaCaT cell lysate by SPR method. The immunological analysis of the recovered samples proved that the method is suitable for the detection of PP1c and PP2Ac as well as their interacting proteins and for the changes of their phosphorylation state after pathological challenges of HaCaT cells. In summary, our results suggest that the tannin components represent a new and effective family of phosphatase inhibitory compounds, which are less toxic than the natural phosphatase inhibitory toxins and their chemical modification may be promising to develop selective inhibitors for the distinct phosphatase types. The interaction characteristics of phosphatase inhibitors to membrane lipids influence the inhibitory effect in a cell type dependent mannar. The immobilized MC-LR on the surface of SPR sensor chip is suitable for isolation of phosphatase catalytic subunits as well as their interacting proteins followed by immunological detection from differently treated cell lysates.

Leírás
Kulcsszavak
Felületi plazmonrezonancia, Szenzor chip CM5, SA, L1, Lipid micella immobilizálás, Protein foszfatáz inhibitorok, Protein foszfatáz-1 (PP1), Protein foszfatáz-2A (PP2A), Protein foszfatáz kölcsönható partnerek, Protein foszfatáz aktivitás, Biotinilált mikrocisztin, Tannin, Surface Plasmon Resonance, Sensor Chip CM5, SA, L1, Immobilization of lipid micelle, Protein phosphatase inhibitors, Protein phosphatase-1(PP1), Protein phosphatase-2A (PP2A), Protein phosphatase interacting partners, Protein phosphatase activity, Biotinylated microcystin
Forrás