A doktori értekezésemben bemutatott munka során a migratorikus, kondrogenikus progenitor sejtek purinerg szignalizációját, valamint a SERCA1b fehérje csökkent expressziójának hatását vizsgáltuk vázizomsejtekben. Az értekezésben szereplő legfontosabb új eredményeket az alábbiakban foglaltam össze: • A CPC-kben spontán megjelenő Ca2+-oszcillációért elsősorban a belső raktárakból történő Ca2+-felszabadulás és a raktár által vezérelt Ca2+-belépés tehető felelőssé. Ezek a sejtek mind a STIM1, Orai1 fehérjéket, mind pedig az IP3R izoformákat expresszálják, de a RyR altípusai nem mutathatóak ki rajtuk. • Feltételezésünk szerint a purinerg szignalizációs folyamatok is szerepet játszanak a CPC-k kalciumhomeosztázisában, ezért ennek bizonyítása érdekében mRNS szinten és fehérje szinten is megvizsgáltuk a purinerg receptorok altípusainak kifejeződését. Az adenozin receptorok altípusai az A3 kivételével expresszálódnak, a P2X ionotróp purinerg receptorok közül a P2X1, P2X4, P2X5, P2X6 és P2X7 altípusok voltak kimutathatóak. A P2Y metabotróp purinerg receptorok altípusait is sikerült detektálnunk. Amíg Western-blot technika segítségével a P2Y receptorok közül csak a P2Y1 és P2Y4 volt detektálható, addig a P2X receptorok 5 izoformáját sikerült kimutatnunk. • Az apiráz alkalmazásával defoszforiláltuk az ATP-t és az ADP-t AMP-vé, ami a Ca2+-tranziensek megszűnését eredményezte. Mindebből arra következtettünk, hogy autokrin/parakrin purinerg szignalizáció állhat a Ca2+-tranziensek létrejöttének hátterében, és a Ca2+-függő regulatorikus mechanizmusok fontos szerepet töltenek be a CPC-k differenciációjának folyamatában. • A további vizsgálatainkban sikerült specifikus SERCA1b shRNS-sel stabilan transzfektálnunk C2C12 vázizomsejteket, majd a puromycines szelekciót követően vizsgálni tudtunk olyan sejtpopulációkat, melyekben teljes mértékben (C1) vagy csak részben (C5) sikerült csökkentenünk a SERCA1b expressziót. • Vizsgáltuk a géncsendesítés differenciálódásra kifejtett hatását. A vázizom differenciálódása során megjelenő szabályozó fehérjék expresszióját Western-blot (MyoD, STIM1, CSQ, CaN) és RT-PCR technika (miosztatin, MCIP1.4) segítségével detektáltuk. A teljes mértékben csökkent SERCA1b expressziót mutató sejtekben (C1) a STIM1, CSQ, CaN expressziós szintje csökkenést mutatott, míg a MyoD expressziós szintje nem változott. Továbbá a miosztatin és a MCIP1.4 szintje is csökkent a C1 miotubulusokban. • A funkcionális vizsgálatok során ismétlődő Ca2+-tranzienseket váltottunk ki 120 mM KCl adagolása mellett a SERCA1b expressziót nem mutató sejtekben. A KCl adagolásának kezdő időpontját követően a 20. és a 40. s-ban is szignifikánsan magasabb volt a [Ca2+]i . Ebből arra következtettünk, hogy a Ca2+-visszavétel ezekben a sejtekben jóval lassabb, melyet jól jellemez a maximális pumpa aktivitás megfigyelt csökkenése. • A SERCA1b-t nem expresszáló C1 sejtek csökkent proliferációt mutattak, valamint a miotubulusokban a sejtmagszám is alacsonyabb volt, összehasonlítva a C5, Scr és kontroll sejtek sejtmagszámával.

This Ph.D thesis summarizes the results of investigation of the role of purinergic signalling pathway in migratory kondrogenic progenitor cells and the effect of SERCA1b genesilencing on the differentiation of skeletal muscle cells. The new results presented in this work are the follows: • Ca2+-oscillations observed in CPCs were predominantly dependent on Ca2+-release and store replenishment via store-operated Ca2+ entry. The CPCs express STIM1, Orai1 proteins and all three IP3Rs, but no RyR subtypes were detected. • Since periodic Ca2+ transients in MSCs could be attributed to an autocrine/paracrine purinergic signalling loop and we hypothesised the presence of a similar purinergic signal transduction mechanism also in CPCs. We first carried out a comprehensive mRNA transcript screening for all purinergic receptor mRNAs involved in Ca2+ homeostasis and found that of the A1 adenosine receptor subtypes A1, A2A and A2B, but not A3 adenosine receptor transcripts; of the P2X ionotropic purinergic receptor subtypes P2X1, P2X4, P2X5, P2X6 and P2X7, but not P2X2 and P2X3; and mRNAs for all Gq-coupled P2Y metabotropic purinergic receptor subtypes were detectable using RT-PCR. Next, we applied immunoblot analyses to confirm the presence of these molecules at the protein level. While all five P2X ionotropic purinergic receptor subtypes were confirmed, only P2Y1 and P2Y4 could be identified. • Enzymatic breakdown of extracellular nucleotides by apyrase completely abrogated Ca2+ oscillations, suggesting that an autocrine/paracrine purinergic mechanism may drive Ca2+ oscillations in these cells. Ca2+-dependent regulatory mechanisms can be supposed to influence their differentiation potential. • The role of neonatal SERCA1b on C2C12 cells has also been established. To understand its role during skeletal muscle differentiation, its synthesis has been interfered with specific shRNA sequence. Decreased protein expression was confirmed in the selected clones using a SERCA1b specific antibody at the miotube stage. Clone C1 and another clone (C5) – in which SERCA1b was downregulated to a lesser extent – were selected for further experiments. • The expression of the regulatory proteins of skeletal muscle differentiation was examined either by Western-blot at the protein level (MyoD, STIM1, CSQ, CaN) or by RT-PCR (myostatin, MCIP1.4). The expression level of CSQ and STIM1 were studied by Western-blot analysis. The scrambled shRNA transfection did not modify the expression level of CSQ, while in the clone C5 miotubes the expression showed a moderate decrease. Furthermore, in clone C1 cells only a very weak band could be detected. Similarly, STIM1 expression was slightly reduced in scrambled shRNA transfected and clone C5 cells as compared to the parental cells, while the STIM1 expression was hardly detectable in clone C1. MyoD and CaN were clearly detectable at protein level. The expression of MyoD was found to be unaffected. On the other hand, the CaN showed a remarkable decrease in clone C1 and even in clone C5, as compared to control cell types. Using specific primer pairs, an mRNA transcript analysis of myostatin and the MCIP1.4 was performed. Myostatin showed a significantly decreased mRNA expression in clone C1 as compared to scrambled shRNA transfected cells, thus the myostatin transcript level correlated with the SERCA1b silencing. In parallel MCIP1.4 was proved to be statistically modified in clone C1. • In order to examine the functional consequences of the decreased expression of SERCA1b, repetitive Ca2+-transients have been evoked by applications of 120 mM KCl. The significantly higher [Ca2+]i measured at the 20th and 40th seconds after the beginning of KCl application indicated a decreased Ca2+-uptake capability which was quantified by extracting the maximal pump rate. • In parallel, clone C1 cells showed inhibited cell proliferation and decreased miotube nuclear numbers as compared with scrambled control cells.