c-Fos transzkripciós faktor hetero- és homodimerizációjának kvantitatív vizsgálata élő HeLa sejtekben
Dátum
Szerzők
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt
A c-Fos és c-Jun transzkripciós faktorok, melyek az aktivátor protein-1 (AP-1) családba tartoznak, különböző sejtfolyamatok szabályozásában vesznek részt, mint például a sejtproliferáció, differenciáció, apoptózis és onkogenezis. A c-Fos és c-Jun család fehérjéi leucin cipzárral összekapcsolódó dimerként működnek és számos emlős gén promóter és enhanszer régióiban az AP-1 szabályozó elemeihez kötődnek. A c-Jun fehérjék homodimert, illetve c-Fos fehérjékkel heterodimert alkothatnak. Ezzel szemben korábban számos közleményben leírták, hogy az izolált c-Fos leucin cipzár in vitro nem alkot stabil homodimert. Élő sejtben nem álltak rendelkezésre adatok a c-Fos homodimerizációval kapcsolatban. Kísérleteink során arra kerestük a választ, hogy a túltermelt mennyiségben jelenlevő c-Fos transzkripciós faktor képes-e homodimert alkotni, ugyanis egyes tumorok a c-Fos-t önmagában túltermelik. A dimerizáció létrejöttét fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) technikával konfokális mikroszkóp és áramlási citométer segítségével, illetve fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiával (FCS) vizsgáltuk élő HeLa sejtekben. Vizsgálatainkhoz ECFP-EYFP, illetve EGFP-mRFP1 donor-akceptor párral jelölt c-Fos, c-Jun fúziós fehérjéket, illetve ezek mutánsait használtuk. Dimer transzkripciós faktorok létrejöttének feltétele, hogy legyen asszociáció, ami függ a koncentrációtól és a disszociációs állandótól. Kidolgoztunk egy „FRET titrálási” módszert, melynek segítségével meghatároztuk a c-Fos‒c-Jun heterodimerek és a c-Fos homodimerek disszociációs állandóját élő sejtekben. Emellett kidolgoztunk egy eljárást a fluoreszkáló transzfektált, és nem fluoreszkáló endogén fehérjék abszolút koncentrációjának mérésére élő sejtekben, amely koncentrációkat figyelembe vettük a disszociációs állandók meghatározásánál.
The c-Fos and c-Jun transcription factors, members of the activator protein-1 (AP-1) complex, form heterodimers and bind to DNA via a basic leucine zipper, and regulate the cell cycle, apoptosis, differentiation, etc. Purified c-Jun leucine zipper fragments could also form stable homodimers, whereas c-Fos leucine zipper homodimers were found to be much less stable in earlier in vitro studies. The importance of c-Fos overexpression in tumors and the controversy in the literature concerning c-Fos homodimerization prompted us to investigate Fos homodimerization. FRET and molecular brightness analysis of fluorescence correlation spectroscopy data from live HeLa cells transfected with fluorescent protein-tagged c-Fos indicated that c-Fos formed homodimers. We developed a method to determine the absolute concentrations of transfected and endogenous c-Fos and c-Jun, which allowed us to determine dissociation constants of c-Fos homodimers (Kd=6.7±1.7 μM) and c-Fos–c-Jun heterodimers (on the order of 10-100 nM) from FRET titrations. Imaging fluorescence cross-correlation spectroscopy and molecular modeling simulations confirmed that c-Fos homodimers were stably associated and could bind to the chromatin. Our results establish c-Fos homodimers as a novel form of the AP-1 complex, which may be an autonomous transcription factor in c-Fos overexpressing tissues, and could contribute to tumor development.