c-Fos transzkripciós faktor hetero- és homodimerizációjának kvantitatív vizsgálata élő HeLa sejtekben

Dátum
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt

A c-Fos és c-Jun transzkripciós faktorok, melyek az aktivátor protein-1 (AP-1) családba tartoznak, különböző sejtfolyamatok szabályozásában vesznek részt, mint például a sejtproliferáció, differenciáció, apoptózis és onkogenezis. A c-Fos és c-Jun család fehérjéi leucin cipzárral összekapcsolódó dimerként működnek és számos emlős gén promóter és enhanszer régióiban az AP-1 szabályozó elemeihez kötődnek. A c-Jun fehérjék homodimert, illetve c-Fos fehérjékkel heterodimert alkothatnak. Ezzel szemben korábban számos közleményben leírták, hogy az izolált c-Fos leucin cipzár in vitro nem alkot stabil homodimert. Élő sejtben nem álltak rendelkezésre adatok a c-Fos homodimerizációval kapcsolatban. Kísérleteink során arra kerestük a választ, hogy a túltermelt mennyiségben jelenlevő c-Fos transzkripciós faktor képes-e homodimert alkotni, ugyanis egyes tumorok a c-Fos-t önmagában túltermelik. A dimerizáció létrejöttét fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) technikával konfokális mikroszkóp és áramlási citométer segítségével, illetve fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiával (FCS) vizsgáltuk élő HeLa sejtekben. Vizsgálatainkhoz ECFP-EYFP, illetve EGFP-mRFP1 donor-akceptor párral jelölt c-Fos, c-Jun fúziós fehérjéket, illetve ezek mutánsait használtuk. Dimer transzkripciós faktorok létrejöttének feltétele, hogy legyen asszociáció, ami függ a koncentrációtól és a disszociációs állandótól. Kidolgoztunk egy „FRET titrálási” módszert, melynek segítségével meghatároztuk a c-Fos‒c-Jun heterodimerek és a c-Fos homodimerek disszociációs állandóját élő sejtekben. Emellett kidolgoztunk egy eljárást a fluoreszkáló transzfektált, és nem fluoreszkáló endogén fehérjék abszolút koncentrációjának mérésére élő sejtekben, amely koncentrációkat figyelembe vettük a disszociációs állandók meghatározásánál.


The c-Fos and c-Jun transcription factors, members of the activator protein-1 (AP-1) complex, form heterodimers and bind to DNA via a basic leucine zipper, and regulate the cell cycle, apoptosis, differentiation, etc. Purified c-Jun leucine zipper fragments could also form stable homodimers, whereas c-Fos leucine zipper homodimers were found to be much less stable in earlier in vitro studies. The importance of c-Fos overexpression in tumors and the controversy in the literature concerning c-Fos homodimerization prompted us to investigate Fos homodimerization. FRET and molecular brightness analysis of fluorescence correlation spectroscopy data from live HeLa cells transfected with fluorescent protein-tagged c-Fos indicated that c-Fos formed homodimers. We developed a method to determine the absolute concentrations of transfected and endogenous c-Fos and c-Jun, which allowed us to determine dissociation constants of c-Fos homodimers (Kd=6.7±1.7 μM) and c-Fos–c-Jun heterodimers (on the order of 10-100 nM) from FRET titrations. Imaging fluorescence cross-correlation spectroscopy and molecular modeling simulations confirmed that c-Fos homodimers were stably associated and could bind to the chromatin. Our results establish c-Fos homodimers as a novel form of the AP-1 complex, which may be an autonomous transcription factor in c-Fos overexpressing tissues, and could contribute to tumor development.

Leírás
Kulcsszavak
Fos homodimerizáció, Fos homodimerisation, transzkripciós faktor, disszociációs állandó, fluoreszcencia rezonancia energia transzfer, konfokális mikroszkópia, áramlási citometria, fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia, lézer pásztázó citométer, transcription factor, dissociation constant, fluorescence resonance energy transfer, confocal microscopy, flow cytometry, fluorescence correlation spectroscopy, laser scanning cytometer
Forrás