Az első enzim katalizálta mutarotációt a P. chrysogenum-ban azonosították ami nagyon közeli rokona az A. nidulans-nak. Ezért mind az A. nidulans és mind a P. chrysogenum genomját megvizsgáltuk lehetséges aldóz-1-epimerázokat kutatva. Amikor a humán vagy az E. coli GalM fehérjét vagy a S. cerevisiae Gal10 bifunkcionális fehérje C-terminális részének szekvenciáját használtuk TBLASTN során, két lehetséges gént azonosítottunk, az intronmentes AN3184-et, amit galmA-nak, és a két exont tartalmazó AN3432-őt, amit galmB-nek neveztünk el. Ahhoz, hogy megállapítsuk, hogy a galmA vagy a galmB kódolja a fiziológiásan jelentős galaktóz-mutarotázt, mind a két gént külön-külön és egyszerre is deletáltuk a gomba genomjából, így kaptuk a ΔgalmA, a ΔgalmB egyszeres, és a ΔgalmA/ ΔgalmB dupla hiánymutánsokat. Ezt követően az egyszeres hiánymutáns törzsekbe visszajuttattuk az előzően deletált lehetséges mutarotáz kódoló géneket. Ezen visszatranszformált, túltermelő törzsek kópiaszámát Southern-blot analízissel határoztuk meg. Minden galm mutánst különböző szénforrás tartalmú süllyesztett kultúrákban is megvizsgáltuk. A D-galaktóz felvétel és a biomassza képződés szignifikáns lecsökkent a galmB hiányában a vad törzshöz képest. Ezzel ellentétben a ΔgalmA süllyesztett sejttenyészetekben a referencia törzshöz képest nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést a biomassza képződésben vagy a D-galaktóz koncentráció alakulásában sem. A ΔgalmA/ΔgalmB dupla hiánymutáns fenotípusa a galmB deléciós mutánshoz hasonlított. Egyéb szénforrásokon, így D-glükózon, illetve glicerinen, L-arabinózon nem volt tapasztalható a cukorfogyásban lényeges különbség a vizsgált mutánsok között. A galmB egyszeres és a dupla galmA/galmB A. nidulans hiánymutánsok D-galaktózon vagy L-arabinózon növesztett biomasszák sejtmentes kivonataiban a megfigyelt mutarotáció nem szignifikánsan haladta meg a spontán mutarotáció mértékét a reakció pufferben. Ezzel szemben a galmB túltermelő törzsekben a vad típushoz képest szignifikánsan nagyobb enzimaktivitás volt mérhető, a specifikus aktivitás a kópiaszámmal arányosan változott. Mindazonáltal a galmB túltermelő mutánsai nem befolyásolták a biomassza képződés vagy a cukorfelvétel sebességét, ez alól kivételt képez a galmB deléciós törzsei. Ez azt jelenti, hogy a tesztelt körülmények mellett a mutarotáció a D-galaktóz katabolizmusban nem sebességmeghatározó a vad típusú törzsben. Érdekes módon a galmA túltermelő mutánsainál, így a D-galaktózon vagy a D-glükózon alapuló növekedési profilban vagy az aldóz-1-epimeráz aktivitás alakulásában sem volt fiziológiásan megfigyelhető különbség. A jelen munkánk során először vizsgáltuk meg, hogy nagy koncentrációban az A. nidulans képes-e egyidejűleg metabolizálni a D-galaktózt és az L-arabinózt is, vagy a gomba egyértelműen előnyben részesíti az egyik szénhidrátot a másikkal szemben. A gomba a két cukrot egyidejűleg vette fel, és többé-kevésbé hasonló sebességgel fogyasztotta. A két monoszacharid felhasználásnak sebessége meglehetősen hasonlónak tűnik, mindkét szénforrást kb. 72 óra (3 nap) alatt hasznosította a mikroba. Mindazonáltal úgy tűnik, hogy a vegyes tenyészetben a pentóz némileg gyorsabban hasznosul, mint a hexóz. Az L-arabinóz és a D-galaktóz katabolizmusában részt vevő struktúrgének transzkripciójának tanulmányozására azokat a géneket választottuk, amelyek fontossága funkcióvesztéses galaktokináz (galE), mutarotáz (galmB) és arabitol-dehidrogenáz (ara1) mutánsokkal már bizonyítható volt az A. nidulans-ban. Mindhárom mutáció befolyásolja a D-galaktóz hasznosítás sebességét. A legnagyobb gátló hatás ΔgalE esetében volt, a rendelkezésre álló szénforrásnak csak 20% -át fogyasztotta 120 órával a beoltás után. Az araA1 mutánsban az alternatív útvonal L-arabinitol (galaktitol):NAD+ dehidrogenáz enzim hiánya lelassította a növekedést, így a galaktóz kimerülése a 3 nap helyett 5 napig tartott. Ezekből az adatokból az alternatív oxidoreduktív útvonal becslésünk szerint 12,5-44,2 % -ban járul a D-galaktóz hasznosításához. A mutarotáz hiánytörzs (ΔgalmB) D-galaktóz fogyasztása nagyon hasonlít az L-arabinitol-dehidrogenáz null mutánséhoz, sokkal kevésbé korlátozva azt, mint a galaktokináz deletált mutánst. Másrészt a galaktokináz és galaktóz mutarotáz deléciók nem mutatnak jelentős hatást az L-arabinóz hasznosíthatóságára. Három nappal a beoltás után a pentóz mindig kimerült a vad típusú, a galaktokináz- és a mutarotáz-hiánymutánsok esetében, míg az L-arabinitol-dehidrogenáz-mutánsnál 3 nap után mintegy 75 %-a és 5 napos rázatás után a szénforrás körülbelül 40 %-a maradt meg. A galaktóz metabolizmusban funkcionálisan részt vevő három gén transzkripciójával párhuzamosan a D-xilulokináz (xkiA) gént is vizsgáltuk, ami csak a pentóz lebontásban játszik szerepet, de elengedhetetlen a pentóz-foszfát nem oxidatív részében. Glicerinen előnövesztett tenyészeteket glicerint, csak D-galaktózt, csak L-arabinózt és együtt D-galaktózt, L-arabinózt tartalmazó tápoldatba mostuk át. Amint vártuk, az L-arabinitol-dehidrogenáz gén (araA) a vizsgált szénhidrátokon kifejeződött, mivel az feltételezhetően mindkét cukor metabolizmusában részt vesz. Az L-arabinózzal indukált tenyészetekben az expresszió szint hamarabb elérte a maximumot, mint D-galaktózon. Az aldóz katabolizmusban az oxidoreduktív útvonal Leloir útvonalhoz képest kisebb arányban játszik szerepet. A xilulokináz (xkiA) gén minden vizsgált szénforráson (kontrol glicerinen is) indukálódott, és némileg nagyobb mértékű génexpresszió csak 8 órával L-arabinózra történő átoltás után volt megfigyelhető. Ezzel ellentétben a galaktokináz (galE) és az araA1 gén kifejeződésére úgy tűnik, hogy mindkét szénhidrát hatással volt, az L-arabinóz tenyészetekben az expressziós szint hamarabb elérte a maxiumot, mint D-galaktózon. Érdekes módon a Northern-blot eredménye azt mutatja, hogy a pentózok hasonló hatást mutatnak, mint a vizsgált aldóz. Ez azért figyelemre méltó, mert a GalE nem vesz részt az oxidoreduktív L-arabinóz metabolizmusában, mivel a Leloir útvonal első lépésében az alfa-D-galaktopiranozid C1 pozíciójú irreverzibilis foszforilációját katalizálja. Ezenkívül a galaktóz 1-epimeráz (galmB) génjének a pentózokon tapasztalható indukció nagysága nagyobb, mint a D-galaktóz jelenlétében. A galmB transzkriptuma alig kimutatható a glicerin kontroll mintáiban. Funkcionális értelemben a galmB L-arabinóz generálta hiperindukciója fiziológiailag aberránsnak tűnik, mivel a gén deléciója nem vezetett a növekedés gátláshoz vagy csökkenéshez a pentózon. Ami olyan szempontból logikus, hogy az oxidoreduktív útvonal mind az öt enzime kizárólagos szubsztrátja az aldóz és a ketóz intermedierek szabad aldehid, azaz a cukrok lineáris, és nem anomer hemiacetál vagy hemiketál formája. A szabad aldehidforma az anomer interkonverzió közbenső terméke, de a mutarotáz enzimhez kötődik, azaz a mutarotáz elméletileg nem növeli a szabad aldehid forma koncentrációját a sejtben. Az együttesen L-arabinózt és D-galaktózt is tartalmazó tápoldatokra átmosott 8 órás tenyészet négy kiválasztott génje alapvetően hasonlóan viselkedett, mint pentózon. A 24 órás galmB és araA indukciós szintjei hasonlóak voltak, mint csak L-arabinózos tenyészetekben, egyértelműen jobban expresszálódtak, mint csak az aldózon önmagában. A galE-t a kevert szénforráson talán némileg jobban fejeződött ki, mint az önmagában L-arabinózon vagy D-galaktózon. Eredményeinkből azonban nem tudjuk megállapítani, hogy a galaktokináz gén kizárólag a D-galaktózra reagál-e 24 órával az indukció után, vagy van esetleg additív hatása az L-arabinóz együttes jelenlétének is.

The organism in which enzyme-catalyzed mutarotation was first discovered, Penicillium chrysogenum, is closely related to A. nidulans. We screened the genome sequences of A. nidulans and P. chrysogenum for putative homologues of characterized galactose mutarotases. Regardless whether we employed the human enzyme, E. coli GalM or the C-terminal domain of the S. cerevisiae Gal10p bifunctional protein as the query in TBLASTN screening, two genes were identified in A. nidulans: an intronless gene at locus AN3184 we have called galmA – in concordance with the E. coli galactose operon gene for mutarotase, galM – and a two-exon gene at locus AN3432, galmB. To investigate whether galmA and galmB encode physiologically relevant D-galactose mutarotases, the two genes were knocked out individually – giving rise to deletion strains galmA and galmB – as well as simultaneously, resulting in galmA/galmB double mutants. Strains in which the functional galm genes were re-introduced in their respective single gene-deleted backgrounds were also generated. These latter strains carry one or more (i.e., two, three, four or five) gene copies at ectopic loci as revealed by Southern-blot analysis. All these galm mutant strains were subjected to phenotypic analysis in submerged cultivations. The absence of galmB resulted in a considerable decrease in the amounts of D-galactose taken up while biomass formation was significantly delayed as compared to the wild-type control. In contrast, time profiles of biomass formation as well as D-galactose residual concentrations of the galmA deletion mutant cultures were not different from those of the wild-type reference. Double galmA/galmB deletion mutants grew as good as the single galmB deletion mutants on D-galactose. Assaying cell free extracts from D-galactose-grown or D-glucose-grown biomass of the galmB single- and galm double A. nidulans mutants, the observed mutarotation did not significantly exceed the spontaneous anomer conversion found in the reaction buffer or in heat-inactivated cell free extracts. On the contrary, galmB multicopy strains displayed significantly higher enzyme activities than the wild type, increasing with the copy number. Nevertheless, overexpressing (multi-copy) mutants of galmB did not affect the growth or sugar uptake, implying that catalyzed mutarotation is not rate-limiting for D-galactose catabolism in the wild type background under the tested conditions. On the other hand, overexpression of galmA from multiple copies did not have any physiological effect on growth on D-galactose or on D-glucose mutarotation either. Importantly, both galm genes were expressed under the growth conditions used in this study on D-glucose as well as on D-galactose. No physiological effects were observed from galm overexpression on any of the other growth substrates tested (D-glucose, D-fructose, glycerol). For the present work, we therefore first assessed whether A. nidulans grows simultaneously on D-galactose and L-arabinose or whether the fungus has a clear preference for one of them on a mixed carbon source of these sugars at high concentration. The fungus takes up and consumes these two sugars concomitantly at more or less comparable rates. The performance of the two sugars appears rather similar when cultured individually, as both are exhausted by 72 h (3 days) of cultivation. Nevertheless, in the mixed culture, the pentose appeared to be consumed faster than the aldose. To monitor the transcription of structural genes involved in catabolism of L-arabinose and D-galactose in response to these two sugars, we selected those genes whose involvement was proven with loss-of-function galactokinase (galE) galactose-1-epimerase (galmB) and L-arabitol dehydrogenase (araA1) mutants in A. nidulans. All three mutations had effects on the consumption of D-galactose, galE having the biggest impact, although residual growth by means of the alternative pathway persists. Lack of the alternative pathway enzyme L-arabitol (galactitol):NAD+ dehydrogenase (araA1 mutant) slows down the growth such that it takes 5 days instead of 3 days before the galactose is exhausted, while the culture in which the Leloir path is blocked (galE) had consumed only 20 % of the available carbon source at 120 h after inoculation. From these data one can estimate the contribution of the alternative oxidoreductive route to the growth on galactose when both pathways are operative at 12.5-44.2 %. The performance of the strain lacking mutarotase (galmB) is more similar to that of the L-arabitol dehydrogenase null mutant, far less restricted than the galactokinase deletant. On the other hand, the galactokinase and galactose mutarotase deletions do not appear to have considerable effects on the performance on L-arabinose with the pentose exhausted three days after inoculation, while growth by the L-arabitol dehydrogenase loss-of-function mutant is clearly delayed, with some 75 % of the carbon source still available by the time the L-arabinose is exhausted in the wild type, the galactokinase- and the mutarotase loss-of-function mutants, and some 40 % left after 5 days of cultivation. We probed the transcription of the three genes functionally involved in galactose catabolism in parallel with that of the D-xylulokinase (xkiA) gene, which is only involved in pentose catabolism but is essential for the flux into the nonoxidative part of the pentose phosphate pathway, during batch cultivation of the A. nidulans wild type strain. The glycerol-grown mycelia were transferred to fresh minimal medium with either L-arabinose, D-galactose, the mixed carbon source L-arabinose plus D-galactose or glycerol as the sole carbon source. As can be expected, expression of the L-arabitol dehydrogenase gene (araA) is induced by both tested sugars as it is implicated in the catabolisms of either, albeit in the L-arabinose cultures it is expressed to higher levels and earlier after inoculation than in the D-galactose cultures. The oxidoreductive pathway is the minor alternative of the Leloir route for catabolism of the aldose. The xylulokinase (xkiA) gene has a high basal level of expression and some overexpression is only apparent on L-arabinose, 8 h after medium transfer. In contrast, the galactokinase (galE) gene appears to respond to both sugars, again seemingly earlier in the L-arabinose cultures than in the D-galactose cultures. Interestingly, the Northern suggests that the overall reponse to the pentose is of the same order as that to the aldose. This is remarkable because GalE is not involved in oxidoreductive L-arabinose catabolism as it catalyses the first dedicated step of the Leloir path: the irreversible phosphorylation of alpha-D-galactopyranoside at C1. Furthermore, the response of the galactose 1-epimerase (galmB) gene to the pentose sugar appears to be one order of a magnitude higher than the induction observed in the presence of D-galactose, the anomers of which are the principal substrates of the intracellular mutarotase. galmB does respond to D-galactose as transcript is hardly visible in the glycerol control samples. In functional terms, this hyperinduction of galmB on L-arabinose seems physiologically aberrant as deletion of the gene does not lead to a growth phenotype on the pentose which is logical because all five enzymes of the oxidoreductive path are exclusively active on the free aldehyde of the aldose and ketose intermediates, and not on their anomeric hemiacetal or hemiketal forms. The free aldehyde form is the intermediate of anomer interconversion but it remains bound to the mutarotase enzyme. On the mixed carbon source of L-arabinose and D-galactose after 8 h of contact time, the four diagnostic genes essentially behaved like they did in response to the pentose alone. At 24 h after medium transfer, the galmB and araA induction levels remained similar to their respective responses in the L-arabinose-alone cultures, clearly better expressed than on the aldose alone. Conversely, galE is now expressed to higher levels on the mixed carbon source than in the biomass grown on L-arabinose alone and the transcript level rather seems more similar to that in D-galactose-only cultures. However, from our results we cannot conclude whether the galactokinase gene is responding exclusively to D-galactose at 24 h after transfer or whether there is an additive effect from the co-presence of L-arabinose.