Az elmúlt évtizedekben az uveális melanomás (UM) betegek átlagos túlélése az alkalmazott terápiák ellenére semmit sem változott. Metasztázis esetén a betegek átlagos túlélése nem éri el az egy évet sem, ráadásul a primer tumor kezelésétől függetlenül az esetek több mint felében kialakul áttét. A borzasztó statisztikák hátterében leginkább az UM sejtek szervezeten belüli gyors szóródása és a hagyományos kemoterápiára való érzéketlensége állhat. Az LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone) citotoxikus peptid analógjai számos esetben hatékonynak bizonyultak nemi hormon függő daganatokban, mint az endometrium, petefészek és prosztata daganatok, de a nemi hormonoktól nem függő daganatok esetén (mint a humán UM) ismereteink meglehetősen korlátosak.

Vizsgálataink célja az volt, hogy kiderítsük a célzott terápiára alkalmas LHRH receptor és ligand kifejeződését humán UM esetén, valamint egy olyan modell felállítása, amely alkalmas a DOX-nal konjugált citotoxikus LHRH analóg (AN-152, AEZS-108, zoptarelin doxorubicin) sejtszintű felvételének vizsgálatára doxorubicin (DOX) rezisztens esetben is.

39 humán uveális melanoma szövetminta esetén került meghatározásra a teljes hosszúságú LHRH receptor és az LHRH ligand expressziója RT-PCR segítségével. Radioligand kötési vizsgálattal határoztuk meg 10 minta esetében a specifikus ligandkötés tulajdonságait. Az LHRH receptor fehérje a szövetminták esetén immunhisztokémia segítségével is igazolásra került. A DOX rezisztens UM sejtes modell kialakításához lépésenként növekvő DOX koncentráció mellett növesztettünk OCM3 humán UM sejteket. A DOX érzékeny (OCM3) és rezisztens (OCM3DOX320) sejtek LHRH receptor expresszióját exononként RT-PCR segítségével, míg fehérje szinten immuncitokémiával vizsgáltuk. A sejtekben a DOX és AN-152 felvételét konfokális lézer pásztázó mikroszkóppal tettük láthatóvá. MTT vizsgálat segítségével hasonlítottuk össze a DOX és AN-152 sejtproliferációra gyakorolt hatását mindkét sejtvonalon.

Az 1-es típusú LHRH receptor magas százalékban (46%) kifejeződik az általunk vizsgált szövetminták esetén, míg a LHRH ligand a minták 69%-ban mutatott expressziót. Tízből 7 esetben a minták erős ligand kötési affinitást mutattak a ligandkompetíciós vizsgálatokban. Az immunhisztokémia szintén megerősítette a LHRH receptor jelenlétét a szövetminták esetén. Sikeresen kialakítottunk egy stabilan osztódó DOX rezisztens humán UM sejtvonalat. A vizsgálataink alapján az OCM3 és az OCM3DOX320 sejtvonalak is kifejeznek LHRH receptor splice variánst és sikeresen igazoltuk az AN-152 LHRH receptor izoformáin keresztüli felvételét a fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatokkal. Az AN-152 hatékonyan képes volt dózisfüggő módon gátolni a sejtproliferációt mindkét sejtvonalban.

Eredményeink alapján az LHRH receptor és annak izoformái alkalmas molekuláris célpontjai lehetnek egy modern, hatékony, célzott terápiának UM és annak metasztázisai esetén.

In the past decades, the average survival of patients has not changed in the case of uveal melanoma (UM). The average survival of metastatic patients with UM is less than one year, and despite the treatment of the primary tumor, metastases develop in more than half of the patients. The drawbacks of bad statistics are the rapid dissemination of the tumor cells but resistance to chemotherapy also plays a major role. Cytotoxic LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone) analogs can be effectively used for targeting sexual hormone-dependent malignancies like endometrial, ovarian and prostatic cancers but the application of these analogs in hormone-independent cancers such as human uveal melanoma (UM) is not examined jet.

The aims of the current study were to investigate the expression of LHRH receptor and ligand in human UM tissues, as a potential novel therapeutic target. We also established a new in vitro model to study the cellular uptake and efficacy of cytotoxic LHRH analog AN-152 (AEZS-108, zoptarelin doxorubicin) in a doxorubicin-resistant UM cell line.

The expression of LHRH receptor and LHRH ligand was tested in 39 human UM specimens by RT-PCR with specific primer set for full length LHRH receptor. Radio ligand binding characteristics of LHRH receptors were studied in tumor membranes of ten UM specimen. The presence of LHRH receptor protein has been confirmed by immunohistochemistry. We established a new doxorubicin (DOX) resistant UM cell line by stepwise administration of DOX to OCM3 human UM cells. The LHRH receptor expression of DOX sensitive (OCM3) and DOX resistant (OCM3DOX320) UM cell lines was determined by exon specific RT-PCR and the immunocytochemistry. Cellular uptake and intracellular distribution of DOX and AN-152 were imaged with confocal laser scanning microscopy. Comparative cytotoxic activity of DOX and AN-152 were tested on both cell line by MTT assay

High percentage (46%) of UM specimens expressed the mRNS of full length type 1 LHRH receptor and 69% of samples were positive to LHRH ligand expression. 70% of the tissue samples showed high ligand binding affinity to LHRH receptors. Immunohistochemistry also confirmed the presence of LHRH receptors. We were able to establish a new DOX resistant UM cell line. Our study demonstrated the expression of LHRH receptor splice variants and protein isoforms in OCM3 and OCM3DOX320 cell lines. The cellular uptake of AN-152 was confirmed by fluorescent microscopy. Based on the MTT assay AN-152 effectively inhibited cell proliferatin in both cell line in dose dependent manner.

Our results demonstrated that LHRH receptors and its isoforms can be potential molecular targets for an effective targeted therapy of UM and its metastases.