A munkám első felében vizsgáltuk a krónikus hipoxia és hiperoxia különböző szignalizációs folyamatokra gyakorolt hatását szívizomban. A 28 napon át módosított oxigén tartalmú levegőben tartott állatok szívében korrelációs összefüggéseket tapasztaltunk az oxigén koncentráció változása és egyes útvonalak aktiválódása között. A redox egyensúly felborulása kifejezettebb volt hipoxiás, mint hiperoxiás körülmények között. A krónikus hipoxia (10% O2) indukálta a HIF-1α-t, amely valószínűsíthetően összefüggésben van az emelkedett oxidatív stresszel. Hiperoxiás körülmények között azonban sem a HIF-1α, sem pedig a HIF-2α szintje nem változott. Lineáris kapcsolatot tapasztaltunk a levegő oxigén szintjének változása és az apoptózisra utaló Bax/Bcl-2 arány között, továbbá TUNEL vizsgálattal hipoxiás és hiperoxiás körülmények között is megnövekedett DNS törést detektáltunk, bár a TdT-pozitív sejtmagok száma fokozottabb volt hiperoxiát követően. Western-blot eredményeinkből kiderült, hogy a hipoxiás (10% O2) kezelés hatására megnövekedett a Beclin-1 fehérje szintje, ezáltal aktiválódott az autofágia folyamata, azonban az LC3B-II és p62 szintje is változatlan maradt, amely arra enged következtetni, hogy nem megy végbe a teljes folyamat. A módosított oxigén tartalmú levegő nem volt hatással az általunk vizsgált túlélési útvonalak aktiválódására. Azonban eredményeink azt sugallják, hogy a belélegeztetett oxigén koncentrációjának változtatása hatással van a tubulin, az aktin és a GAPDH fehérjék szintjére is, amely felhívja a figyelmet a háztartási fehérjékkel történő normalizált adatok óvatos kezelésére. Tanulmányoztuk továbbá a magas koncentrációjú hemoxigenáz-1 indukáló szerek hatását is szívizomsejteken, keresve arra a választ, hogy a HO-1 magas expressziója milyen hatással van az autofágia folyamatára. Eredményeink alapján elmondható, hogy a hemin és CoPPIX koncentrációfüggő módon csökkentette a H9c2 sejtek életképességét. A legmagasabb koncentráció, mindkét indukáló szer esetében megközelítette, vagy el is érte a toxikus IC50-es értéket. Továbbá a hemin és CoPPIX esetében is sikeres és koncentrációfüggő HO-1 expresszió emelkedést tapasztaltunk. Az általunk vizsgált két indukáló szer 100 µM-os koncentrációban szignifikánsan emelte a ROS szintjét, amely jelentős mértékű oxidatív stresszre utal, és ez egy magyarázat lehet a sejtek életképességének csökkenésére. Eredményeinkből egyértelműen látszik, hogy a 100 µM hemin és CoPPIX Beclin-1 függelten útvonalon aktiválja az autofágiát. Azonban az LC3B-II és p62 szignifikánsan magasabb expressziós szintje a kezelt csoportokban megkérdőjelezi a folyamat teljességét. Ezen eredményeinket alátámasztva, a 100 µM hemin és CoPPIX mellett Klorokinl is kezeltük a szívizomsejteket, és Cyto-ID Green festéssel vizsgáltuk az autofágiás flux változását. Mikroszkópos és áramlási citometriás kísérleteink is támogatták azon feltételezésünket, hogy a toxikus koncentrációjú hemin és CoPPIX emelkedett, ám funkcióját vesztett autofágiát indukálnak. Az autofágia mellett tanulmányoztuk az apoptózis szintjét is. Vizsgáltuk a pro-kaszpáz-3-at, amely expressziójának csökkenése, valamint a hasított kaszpáz-3 emelkedése, az apoptózis aktiválódására enged következtetni. Eredményeink alapján a magas koncentrációjú HO-1 indukáló szerek okozta sejttoxicitás az emelkedett oxidatív stresszből, a nem megfelelően funkcionáló autofágiából és a magas szintű apoptózisból eredhet.

In the first part of our experiments, we investigated the effects of the different inhaled O2 tensions (10-21-30%) on various pathways in myocardium. 10% O2 appears to cause a considerable level of oxidative stress in heart tissue, which increases the expression of HIF-1α, while 30% O2 does not cause significant oxidative stress as evidenced by unaltered level of ROM derivatives. However, both hypoxia and hyperoxia elevate TUNEL positivity. Alterations in Beclin-1 protein level suggest that altered O2 tensions may have an impact on autophagy. Although a definitive conclusion can not be drawn because the autophagy flux was not measured, a crosstalk between apoptosis and autophagy may have been established under these circumstances. Furthermore, we found that the level of the commonly used housekeeping proteins such as α-tubulin, actin and GAPDH may be altered. Thus, these proteins should be used with caution as loading controls, in experiments when the O2 tension of inhaled air is a variable, and the alternative method to normalize densitometry values against total protein content is to be taken into consideration. In the other study we also investigated the influence of toxic dosis of HO-1 inducers (hemin and CoPPIX) on level of oxidative stress, the pathway of autophagy and apoptosis in H9c2 cells. Our results showed decreased cell viability at high dose of hemin and CoPPIX treated H9c2 cells in a dose-dependent manner. As expected both treatments induced a robust elevation of HO-1 level. Furthermore, at concentration of the inducers used in the present study, a significantly enhanced level of ROS was detected. In addition, the Beclin-1- independent autophagy was significantly increased, but it caused a defective autophagic flux with triggered activation of apoptosis.