Új citometriai módszereket dolgoztam ki genetikai és epigenetikai kérdések megválaszolására: (A) rövid DNS régiókban bekövetkező hossz-változások, illetve DNS szekvenciabeli eltérések detektálására, (B) nukleoszóma stabilitás in situ mérésére, valamint (C) nukleoszómákkal asszociált epigenetikai módosítások analízisére. (A) Az áramlási citometriás platformra épülő genetikai teszt sztreptavidint hordozó mikrogyöngyök felszínén immobilizált és fluoreszcensen jelölt PCR termékek Tm analízisén alapul. A módszer felhasználhatóságát, érzékenységét a Huntington chorea hátterében álló triplet expanzió, illetve a BRCA1 gén egyik pontmutációjának kimutatásával demonstráltam. (B) A pásztázó lézermikroszkópos (citometriás) platformra épülő nukleoszóma stabilitást vizsgáló in situ módszer a hisztonok sókezelés vagy interkalátorral történő kezelés hatására bekövetkező, kromatinról történő disszociációjának mérésén alapul. A sókezelés a nukleoszómák ionerősség-függő, az interkalátor kezelés a nukleoszómák DNS szuperhelicitás-függő stabilitásának mérését teszi lehetővé, hiszton PTM ill. hiszton variáns specifikus módon. A módszert különböző hiszton PTM-ek, illetve a H2A.Z, H2A.X és γH2A.X hiszton variánsok összehasonlító vizsgálatára használtam fel. Kimutattam, hogy a kromatin relaxációja (nick-ek létrehozásával) nukleoszóma destabilizációt okoz, amelynek jelentős szerepe lehet a DNS hozzáférhetőségének epigenetikai szabályozásában. A ≥10 kb távolságban létrehozott nick-ek általi relaxáció már elégségesnek bizonyult a nukleoszómák többségének destabilizációjához, ami azt mutatja, hogy a bevitt nick-ek hatása nem lokális, a relaxáció tovaterjed kromatin hurok méretű távolságokra. A módszerrel végezhető megfigyelések potenciális biológiai jelentőségét mutatja a H2A.Z reader protein nukleoszóma stabilitást befolyásoló funkciójának kimutatása is. (C) Az áramlási citometriás és pásztázó lézermikroszkópos citometriás platformra épülő epigenetikai teszt izolált, mikrogyöngyökön immobilizált mononukleoszómák epigenetikai módosítás kombinációinak analízisén alapul. Ez a mérési elv alkalmasnak bizonyult nick-ekhez közeli, iniciáló ill. elongáló RNS-polimeráz II molekulák ill. R-loop-ok differenciális detektálására. Általános konklúzióként megállapítható, hogy a citometriás analízisre épülő és a molekuláris biológiai metodikák előnyös kombinációi alapvető genetikai és epigenetikai kérdések megválaszolására, gyakorlati problémák megoldására kínálnak új, még kevéssé kiaknázott lehetőségeket.

Novel cytometric methods were developed for genetic and epigenetic analyzes: (A) for the detection of certain genetic alterations of the length or in the sequence of short genomic regions, (B) for the in situ evaluation of nucleosome stability and (C) for the “ChIP-on-beads” analyzes of nucleosome-associated epigenetic modifications. (A) The flow cytometry assay I developed to address genetic diseases is based on the melting point analyzis of PCR products carrying biotin and a fluorescent moiety on their two ends, and are immobilized on streptavidin-coated microbeads. The efficacy and sensitivity of the method is demonstrated in the case of CAG triplet expansion in Huntington’s disease and a BRCA1 point mutation. (B) The laser scanning cytometric assay I developed for the purposes of in situ evaluation of nucleosome stability is based on the elution of histones using intercalators or salt, so as to assess stability features dependent on DNA superhelicity or electrostatic interactions, respectively. The assays can be preformed on a PTM or histone variant dependent manner. The utility of the method is demonstrated via the comparative analyzes of different histone PTMs and histone variants, including H2A.Z, H2A.X and its phosphorylated form, γH2A.X. It was also demonstrated that DNA relaxation (by nicking) destabilizes nucleosomes, what underscores the powerful potential of topological relaxation in the epigenetic regulation of DNA accessibility. Notably, nicking at ≥10 kb intervals is sufficient to induce global nucleosome destabilization, demonstrating that relaxation is propagated along most of the nucleosomes of the relaxed chromatin loops. The novel observations of biological significance I made employing this method include the demonstration of the nucleosome destabilizing effect of a reader protein in the case of H2A.Z. (C) The cytometric assays developed for the “ChIP-on-beads” analyzes of nucleosome-associated epigenetic modifications are based on the measurement of PTM combinations on isolated mononucleosomes immobilized on microbeads. This experimental system proved useful also for the differential detection of initiating and elongating RNA Pol II molecules and R-loops juxtaposed with nicks. As a general, methodical conclusion, suitable combinations of cytometric approaches with molecular biological methodology can offer a novel outlook on a wide variety of genetic and epigenetic questions of both practical and fundamental biological importance, with many potentialities yet to be exploited.