Dolly, az első testi sejtből klónozott állat megszületése óta eltelt 10 évben sikerült minden gazdasági haszonállat esetében alkalmazni a sejtmagátültetés módszerét, de dacára az intenzív kutatásoknak a sejtmagátültetéssel módosított embriók csak mintegy 1-4%-ából lesz élő utód. Az alacsony hatékonyságért a rendszer bonyolultságából adódóan számos tényező a felelős, növelése érdekében a technika összes lépésének javítása szükséges. A petesejt mesterséges aktiválása a sejtmagátültetéses klónozás fontos lépése, ami az embrionális fejlődés beindításáért felelős, gyakorlati alkalmazásán túl lehetőséget nyújt a termékenyülés alatt bekövetkező sejt- és molekuláris szintű változások tanulmányozására is. Az elmúlt évtizedekben számos eljárás került kifejlesztésre a meiotikus sejtciklus újraindítására, azonban e területen további kutatások szükségesek.

A dolgozat elkészítése során célul tűztük ki a különböző parthenogenetikus aktiválási módszerek in vitro érlelt sertés petesejtekre kifejtett hatásának vizsgálatát. Kísérleteink során elvégeztük a tenyésztési környezet embriófejlődésére gyakorolt hatásának értékelését, mely során összehasonlítottunk két tenyésztőmédiumot, valamint különböző oxigén koncentrációkat. Meg kívántuk vizsgálni a sejtciklus szabályozásában kulcsszerepet játszó két fehérje, az MPF (M-fázist elősegítő faktor) és MAPK (mitogen-aktivált protein kináz) aktivitás-változását az alkalmazott aktiválási módszereket követően.

Kísérleteinkhez vágóhídi petefészkekből származó, in vitro érlelt sertés petesejteket használtunk. Három parthenogenetikus aktiválási módszer hatását vizsgáltuk. Az első módszer szerint a petesejteket két, egyenként 60 μsec-ig tartó, 1,2 kV/cm-es feszültségű egyenáramú impulzussal aktiváltuk (EP). A második módszer alapján a petesejteket elektroporációt követően butyrolactone I (specifikus cdc2/cdk2 blokkoló) kezelésnek vetettük alá (EP+BL); míg a harmadik csoportban az elektroporációt a petesejtek cycloheximide (általános fehérjeszintézis gátló) jelenlétében történő inkubációja követte (EP+CHX). A tenyésztőmédium mindhárom aktiválási módszer esetében tartalmazott cytochalasin B-t is, ezáltal biztosítva a kifejlődő embriókban a diploid kromoszóma-szerelvény kialakulását. Az első kísérletsorozatban az aktivált petesejteket 7 napig tenyésztettük 39ºC-on, 5% CO2 szint mellett NCSU-23 illetve PZM-3 médiumban. A tenyésztés során meghatároztuk a pronukleuszt-képződést, az osztódott embriók számát, valamint a blaszotciszta stádiumig jutott embriók arányát. Megállapítottuk továbbá a 7 napos blasztociszták sejtszámát és az egyes blasztocisztákban található, programozott sejthalált mutató nukleóluszok arányát is.

A második kísérletben az aktivált petesejteket PZM-3 médiumban, 5% ill. 20% O2 koncentrációt tartalmazó légtérben inkubáltuk. Ezen embriók esetében is meghatároztuk az osztódott, a blasztocisztát képzett és a kikelt embriók arányát, valamint a blasztociszták sejtszámát és apoptotikus sejtjeik arányát. Egy további kísérletsorozatban meghatározásra került ezen túlmenően a különböző módszerekkel aktivált petesejtek citoplazmájában az MPF és a MAPK aktivitásának változása is az aktiválást követő 6 óra folyamán, amit a vizsgált enzimek foszfotranszferáz aktivitásának mérésével állapítottunk meg.

Kísérleteink során azt találtuk, hogy az EP+BL és az EP+CHX kezelés hatékonyabban segíti elő a pronukleusz-képződést a használt tenyésztőmédiumtól függetlenül. A protein kinázt blokkoló vagy fehérjeszintézist gátló, kombinált módszerek hatékonyabban stimuláltak embriófejlődést PZM-3 médiumban, mint az elektroporáció önmagában, ily módon magasabb fejlődést tapasztaltunk a blasztociszta stádiumig. NCSU-23 médium használata az előmag-képződés után nem engedte kibontakozni a kombinált eljárások kedvező hatását, kezeléstől függetlenül hasonló fejlődést eredményezve.

A PZM médium ezzel szemben kedvezőbb környezetet teremtett parthenogenetikusan aktivált sertés petesejtek számára a kultiváció során, ez a magasabb blasztociszta fejlődésben, magasabb sejtszámban és magasabb kikelési arányban is megmutatkozott.

PZM médiumban tenyésztve az embriókat a légtér magas (~20%) O2 koncentrációja nem befolyásolta károsan a parthenogenetikus embriók fejlődését az 5% oxigén-nyomás használatához viszonyítva. Hagyományos (5% széndioxid plusz 95% levegőt biztosító) inkubátorok használatával is hatékony embrió-előállításra nyílik lehetőség.

Az elektroporáció két egymást követő egyenáramú impulzus alkalmazásával képes az MPF aktivitásának gyors és tartós csökkentésére, azonban a MAPK kezdeti csökkenése után annak újra-aktiválódása figyelhető meg. A MAPK aktivitásának tartósan alacsony szinten tartása megvalósítható kombinált, a proteinszintézist vagy cdc2/cdk2 kinázokat gátló inhibitorok használatával, aminek jótékony hatása megmutatkozott a jobb korai embrionális fejlődésben.

Összességében megállapíthatjuk, hogy PZM-3 médium használatával, kombinált parthenogenetikus petesejt aktiválási módszerek, függetlenül a tenyésztés alatti O2 koncentrációtól, hatékonyan alkalmazhatók sertés sejtmagátültetéses klónozási protokollok részeként.

Since the birth of Dolly, the first animal derived from a single somatic cell, nuclear transfer has successfully been applied in all domestic animal species. However, the efficiency of the technique is still very low, only about 1 to 4% of the embryos produced are able to develop to term. This low efficiency is due mainly to the complexity of the the procedure, and in order to enhance productivity all the individual steps of the technology need to be improved. Parthenogenetic activation of oocytes is one of the most important steps during which the developmental program of the reconstructed oocyte is artificially stimulated. Oocyte activation is also a reliable tool for investigating the changes that occur during fertilization. Although extensive research has been carried out in the past decade in this field, further research is necessary for the better understanding of the regulation of the meiotic cell division.

The aim of this study was to investigate the effects of different parthenogenetic activation methods and various culture systems on the development of in vitro-matured porcine oocytes. We also evaluated the dynamics of the activity of cell cycle-related regulatory proteins such as MPF (M-phase promoting factor) and MAPK (Mitogen activated protein kinase) in the oocyte following different activation methods.

In vitro matured oocytes obtained from ovaries of prepubertal gilts were used for the experiments. Three different activation methods were tested. The first method included electroporation of the oocytes using two subsequent direct current pulses of 120 V/mm and 60 μs each (EP). According to the second method, the oocytes were electroporated as described and then treated with butyrolactone I, a specific blocker of cdc2 and cdk2 kinases (EP+BL). During the third treatment, electroporated oocytes were incubated in the presence of cycloheximide, a protein synthesis inhibitor for 5 hours (EP+CHX). In the case of all three treatments, the culture media was supplemented with cytochalasin B, an inhibitor of microfilament polymerization, to facilitate the formation of diploid embryos. The activated oocytes were cultured in NCSU-23 or PZM-3 media for 7 days at 39ºC under 5% CO2 in air. After the 7-day culture period the formation of pronuclei, cleaved embryos and blastocysts as well as the number of nuclei and apoptotic nuclei per blastocysts were recorded.

In the second experiment, the activated oocytes were cultured in PZM-3 medium under low (5%) or high (~20%) O2 in the air. The frequency of cleaved embryos, blastocysts, hatched blastocysts, the number of nuclei per blastocysts and the percentage of apoptotic nuclei per blastocysts were determined. In the third experiment, changes in the activities of MPF and MAPK in the oocyte cytoplasm were evaluated after various activation treatments.

We found that electroporation induced lower percentage of pronuclear formation compared to EP+BL or EP+CHX in both media. Furthermore, in PZM-3 using protein kinase or protein synthesis inhibitors after electroporation induced greater development to the blastocyst stage than electroporation alone. The beneficial effects of protein synthesis or protein phosphorylation inhibition were not observed in NCSU-23 medium beyond the pronuclear stage, in this medium development beyond the pronuclear stage was similar after every treatment.

The PZM-3 medium proved superior to NCSU-23 in supporting development of parthenogenetic porcine embryos up to the blastocyst stage during the culture period.

During culture in PZM-3, high O2 tension (~20%) had no detrimental effect on the development of parthenogenetic porcine embryos indicating that traditional CO2 incubators (that provide 5% CO2 in air) can efficiently be used for embryo production.

Electroporation by two consecutive DC pulses causes rapid and efficient MPF inactivation; however, MAPK reactivated following an initial drop in enzyme activity. After electroporation, using protein synthesis- or cdc2/cdk2 kinase inhibitors can efficiently keep MAPK activity at low levels resulting in better preimplantation embryo development.

In conclusion, electroporation combined with chemical treatments that inhibit protein synthesis or block protein phosphorylation by cdc2/cdk2 kinases provides a stimulus that triggers development to the blastocyst stage more effectively than electroporation alone in PZM-3 medium, regardless of the O2 concentration during culture. The combined activation method can be used successfully as part of an oocyte activating scheme during porcine nuclear transfer.