Poly(ADP-ribosyl)ation, catalysed by poly(ADP-ribose) polymerases (PARP-s), is a reversible post-translational modification of glutamate and aspartate residues of nuclear proteins and represents an immediate eukaryotic cellular response to DNA damage as induced by ionizing radiation, alkylating agents and oxidants. The ADP-ribose polymer formed by sequential attachment of ADP-ribosyl moieties form NAD+ can reach high complexity with chain lengths of up to 200 units and multiple branching points. The major enzyme catalyzing poly(ADP-ribose) catabolism is poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG), splitting the polymer’s unique ribose-ribose linkages generating free ADP-ribose units. Here we have investigated the possible role of poly(ADP-ribosyl)ation in cytokine-stimulated A549 cells. Cells were pretreated with a potent PARP-1 inhibitor PJ34 or the PARG inhibitor gallotannin (GT). Cytokines induced the expression of several chemokines and cytokines through NF-B and AP-1 activation in A549 cells which was strongly suppressed by GT and weakly inhibited by PJ34. GT decreased NFB transactivation by inhibiting its nuclear translocation. This effects was due to the inhibition of IB phosphorylation. PJ34 did not affect the nuclear translocation of the transcription factor, however it inhibited its DNA binding. GT also inhibited the DNA binding of the transcription factor, AP-1 even in the absence of cytokines. However, GT did not inhibit the activation of the AP-1 subunits. Moreover, we observed an elevated phosphorylation of c-Jun. GT alone induced phosphorylation of JNK, p38MAPK and ERK and their targets. This might be due to the inhibition of protein phosphatases (PP1 and PP2A). The cytokine exposure stimulated no detectable poly(ADP-ribose) synthesis in either the absence or presence of GT. Lack of poly(ADP-ribose) accumulation in GT-treated cells suggests that no major alteration of poly(ADP-ribose) metabolism occur in A549 cells in response to GT treatment. Since GT didn’t prove to be a suitable tool for the investigation of PARG, we established A549 cell lines with stable suppression of the PARG and PARP1 genes. These knockdown cells were protected from necrosis (propidium iodide uptake) induced by severe oxidative stress, however, they were more sensitive to apoptosis (as measured by caspase activation and DNA fragmentation) induced by mild oxidative stress. We identified inefficient DNA repair as the underlying mechanism of this latter effect. The similar responses of the PARG and PARP1 knockdown cells indicate that PARG knockdown may result in indirect inhibition of PARP-1 via inhibitory auto-poly(ADP-ribosyl)ation.

A poli-ADP-riboziláció, melyet poli(ADP-ribóz) polimerázok (PARP) katalizálnak, egy reverzibilis poszttranszlációs módosítás fehérjék glutamát és aszpartát oldalláncán. A jelenséget elsősorban DNS károsodást követően figyelhetjük meg, melyet okozhat ionizáló sugárzás, alkiláló és oxidatív ágens. A DNS törés hatására aktiválódott PARP-1 szubsztrátjából, a NAD+-ból ADP-ribózt hasít ki, és ezekből az egységekből hosszú, elágazó láncot szintetizál. A folyamat reverzibilitásáért elsősorban a poli(ADP-ribóz) glikohidroláz (PARG) felel, mely ADP-ribóz egységekre bontja a láncot.
Kísérleteink első felében a poli-ADP-riboziláció esetleges szabályozó mechanizmusát vizsgáltuk citokinekkel stimulált A549 sejtekben. A sejteket specifikus PARP-1 gátlószerrel (PJ34) és egy PARG inhibitor vegyülettel (gallotannin, GT) kezeltük elő. A citokin kezelés hatására kemokinek és további citokin gének expressziója jelentős mértékben nőtt, melyet a GT fokozottabb, a PJ34 pedig kis mértékben gátolt. A citokinek génexpressziós hatásukat az NF-B és az AP-1 transzkripciós faktorokon keresztül fejtették ki. Mind a GT, mind a PJ34 gátolta a NF-B transzaktivációját; a GT gátolta az IB foszforilálódását, és emiatt az NF-B sejtmagba történő transzlokációját, míg a PJ34 gátolta az NF-B DNS-hez való kötődését. A GT gátolta az AP-1 DNS-hez való kötődését is, ez a hatás a citokin kezelés hiányában is fennállt. Érdekes módon, a GT önmagában is kiváltotta az AP-1 egyik komponensének, a cJun-nak a foszforilálódását, sőt indukálta a JNK, p38MAPK és ERK1/2 valamint azok targetjeinek foszforilálódását. Feltételezzük, hogy a jelenség hátterében foszfatáz enzimek (PP1 és PP2A) gátlása áll. Megállapítottuk továbbá, hogy a citokin kezelés nem okozott jelentős poli-ADP-ribóz szintézist, a polimerek akkumulációját pedig nem tudtuk megfigyelni GT jelenlétében. A PARG további vizsgálata céljából stabil géncsendesítést valósítottunk meg A549 sejtekben. Mind a PARG, mind a PARP-1 gén csendesítése rezisztenciát okozott nagy dózisú hidrogén peroxid kezeléssel kiváltott citotoxicitással szemben. Ez a védelem azonban csak rövidtávon érvényesült. Megfigyeltük, hogy alacsonyabb, apoptózist indukáló hidrogén peroxid kezeléssel szemben mind a PARG, mind a PARP-1 csendesített sejtek érzékenyebbek, ennek hátterében pedig azok elégtelen DNS hibajavítását igazoltuk. Az apoptózis az általunk vizsgált rendszerben kaszpáz-függő de az apoptózis indukáló faktortól függetlennek találtuk. A PARP-1 és a PARG csendesített sejtvonalak hasonló viselkedése arra utal, hogy a PARG gátlása fokozza a PARP-1 gátló hatású auto-poli-ADP-ribozilációját.