The Development and Applications of a Recombinant Fluorescent Fusion Protein-Based In Vitro Protease Assay Platform for Kinetic and Specificity Studies

A tétel rövid nézete
dc.contributor.advisorTőzsér, József
dc.contributor.authorBozóki, Beáta
dc.contributor.departmentMolekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskolahu
dc.contributor.submitterdepDE--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
dc.date.accessioned2020-08-31T20:56:41Z
dc.date.available2020-08-31T20:56:41Z
dc.date.created2020hu_HU
dc.date.defended2020-09-11
dc.description.abstractMunkánk célja egy rekombináns fehérje szubsztrátokra optimalizált Ni-NTA mágneses gyöngy-alapú fluoreszcens proteáz vizsgálati módszer kifejlesztése és alkalmazása volt. Az tervezett szubsztrátok tartalmaznak egy N-terminális hexahisztidin és egy maltóz-kötő fehérje fúziós címkét, a Dohány karcolatos vírus proteáz és a vizsgálni kívánt proteáz hasítási szekvenciáját, valamint egy C-terminális fluoreszcens fehérjét (FP). A mágneses gyöngyhöz immobilizált szubsztrátok alkalmazhatóságának igazolására enzimkinetikai, gátlási és pH optimum meghatározási vizsgálatokat végeztünk a dohány karcolatos vírus proteáz és 1-es típusú humán immundeficiencia vírus proteázokra. A mikrocső-alapú mérésekhez kidolgozott módszert mikrotiter lemezre is optimalizáltuk. A fluorimetriás mérések mellett kidolgoztunk egy eljárást, mellyel a redukáló körülmények között végzett SDS-poliakrilamid gél elektroforézist követően a denaturált FP-k a gélben renaturálhatóak, majd a fluoreszcencia alapján detektálhatóak. Célunk volt továbbá egy katalitikusan hatékonyabb venezuelai ló-láz encephalitis vírus 2-es számú nem-szerkezeti fehérje proteáz enzimforma létrehozása is. A kifejlesztett módszert alkalmazva vizsgálatuk a létrehozott enzimformák in vitro aktivitását és specificitását. A kifejlesztett vizsgálati módszer tovább optimalizálható nagy áteresztőképességű és automatizált mérésekhez, és alkalmazható proteáz szubsztrátok azonosítására, gátlószerek vizsgálatára, míg a specificitási vizsgálatok eredményei hozzájárulhatnak a további, alfavírusokat vagy egyéb IV. genetikai csoportba tartozó vírusokat célzó kutatásokhoz. We presented the development and the utility of a Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay platform using recombinant protein substrates. The substrates consist of N-terminal His6 and maltose-binding protein fusion tags, a tobacco etch virus protease cleavage site sequence, the recognition site for the protease of interest and a C-terminal fluorescent protein. To test the on-bead application of the substrates, enzyme kinetic, inhibition, and pH optimum studies were performed on tobacco etch virus and human immunodeficiency virus type-1 PRs. Besides fluorimetric studies, substrates and products were assayed by PAGE, as well. We found that the denatured proteins could be renatured after reducing SDS-PAGE, and the fluorescent proteins were detected in the gel upon blue light and/or UV illumination. The platform was applied in a microplate-optimized format to characterize the in vitro activity and specificity of the purified venezuelan equine encephalitis virus non-structural protein 2 protease constructs. The developed assay platform can be adaptable to HTS and automation-based pharmaceutical protease substrate discovery, inhibitor screening and/or drug development, whereas the results of VEEV PR specificity studies could contribute to the investigation of alphaviruses or other important Group IV viruses.hu_HU
dc.description.correctorLB
dc.format.extent105hu_HU
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2437/291896
dc.language.isohuhu_HU
dc.language.isoenhu_HU
dc.subjectrecombinant proteinhu_HU
dc.subjectprotease
dc.subjectassay
dc.subjectrekombináns fehérje
dc.subjectproteáz
dc.subjectvizsgálati módszer
dc.subject.disciplineElméleti orvostudományokhu
dc.subject.sciencefieldOrvostudományokhu
dc.titleThe Development and Applications of a Recombinant Fluorescent Fusion Protein-Based In Vitro Protease Assay Platform for Kinetic and Specificity Studieshu_HU
dc.title.translatedRekombináns Fluoreszcens Fúziós Fehérje-Alapú In Vitro Proteáz Vizsgálati Módszer Kidolgozása és Alkalmazása Kinetikai és Specificitási Vizsgálatokbanhu_HU
Fájlok
Eredeti köteg (ORIGINAL bundle)
Megjelenítve 1 - 4 (Összesen 4)
Nem elérhető
Név:
Bozoki_Beata_ertekezes_angol.pdf
Méret:
8.07 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
Értekezés
Letöltés
Nem elérhető
Név:
Bozoki_Beata_tezisfuzet_angol.pdf
Méret:
664.1 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
Tézisfüzet (angol)
Letöltés
Nem elérhető
Név:
Bozoki_Beata_tezisfuzet_magyar.pdf
Méret:
736.36 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
Tézisfüzet (magyar)
Letöltés
Nem elérhető
Név:
Bozoki_Beata_Meghivo.pdf
Méret:
56.51 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
Meghívó a nyilvános vitára
Letöltés
Engedélyek köteg
Megjelenítve 1 - 1 (Összesen 1)
Nem elérhető
Név:
license.txt
Méret:
1.93 KB
Formátum:
Item-specific license agreed upon to submission
Leírás:
Letöltés
Gyűjtemények
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola