1. We studied the effect of some biochemical modulators on the myelotoxicity of 5-fluorouracil (5-FU) in mice. To characterize the damage to and recovery of bone marrow, we estimated the cellularity and CFU-GM-content (granulocyte-macrophage progenitor cell) of the femoral marrow as well as neutrophil counts in the blood. 5-FU was used in combination with leucovorin (LV), an agent used in the clinical practice to enhance the cytotoxicity of 5-FU to tumor cells.

1.1. Uridine (U) given after LV+5-FU significantly reduced the severe myelotoxicity of this combination as shown by all of the variables mentioned above. Uridine-diphospho-glucose (UDPG), an agent capable of increasing the plasma U level and possessing a better safety profile in humans than U, produced similar beneficial effects; the significance of this observation is emphasized by the availability of UDPG as a drug licensed for clinical use.

1.2. Filgrastim, a G-CSF preparation, improved the recovery from neutropenia after LV+5-FU. A combination of U-rescue and filgrastim-treatment was more effective in counteracting the unwanted consequences of the highly myelotoxic combination of LV+5-FU than either U or filgrastim alone, almost completely eliminating the neutropenia induced by LV+5-FU; similar results were obtained if UDPG was substituted for U. Explanation: U potentiated the beneficial effect of filgrastim by increasing the number of progenitor cells surviving LV+5-FU and capable of responding to this cytokine. This warrants further studies and may contribute to the more effective clinical use of the combination of LV+5-FU.

1.3. Ethyl-deoxyuridine (EDU) had been reported by other authors to potentiate the antitumor effects of 5-FU in mice. In our studies, it increased the myelotoxicity of 5 FU in mice, especially with fractionated 5 FU dosing, supporting the idea that this effect was mainly due to delaying the recovery of myeloid progenitor cells.

1. We developed a new method for the direct and quantitative measurement of the ratio of TP and DPD, two enzymes supposed to determine the sensitivity of cells to some fluoropyrimidines, in tissue sections by means of a laser-scanning cytometer (LSC). Originally the LSC was developed for quantitative fluorescent measurements in well separated cells on slides but the high density of cells and the various relative positions of cells to the cutting plane in tissue sections makes individual cell detection and measurement very difficult and inaccurate. Thus in tissue sections we applied the phantom contouring feature of the LSC which is an unbiased stereologic approach and can provide much more accurate estimates of fluorescence intensities from the different microanatomical regions in the sections. This method opens up new vistas to test the idea how the simultaneous estimation of various marker enzymes or other proteins in histological samples of human tumors can contribute to the individualized use of antitumor drugs in general, and fluoropyrimidines in particular. Furthermore, our method can be applied for any drug target/metabolic system where the key components are known and for which suitable antibodies can be produced.

2. The above capabilities of LSC could be extended to study the homing of tumor cells, an early event in the formation of metastases, provided that the small minority of tumor cells could be readily identified among the overwhelming majority of normal cells. Green fluorescent protein (GFP) is a useful marker for tumor cells of various origin, so we established a method capable of detecting GFP-positive cells by LSC with a sensitivity of 1:104. This sensitivity was reached by using a method which set the detection threshold above the highest fluorescence level detected in the GFP negative cell population and very specifically discriminates the GFP positive from the GFP negative cells which also show relatively high autofluorescence in the detection channel. Even this relatively low sensitivity is good for detection of GFP-labeled cells and at the same time quantitative measurements of multiple interesting markers in preserved anatomical structures which is not possible with other currently available methods. The combination of the identification of rare tumor cells with the capability of LSC to quantitatively estimate the amount of other labeled markers in the identified tumor cells or in surrounding cells seems to be a promising way of studying the homing of cells.

1. Néhány biokémiai modulátor hatását vizsgáltuk a myelopoiesis 5 FU által okozott károsodására egerekben. A csontvelő károsodásának és restitúciójának jellemzésére meghatároztuk a femorális csontvelő cellularitását és CFU-GM tartalmát, valamint a vérben található neutrofil granulociták számát. Az 5 FU-t LV-nal kombinálva alkalmaztuk, mely a klinikai gyakorlatban alkalmazott szer az 5 FU tumorsejt ellenes toxicitásának növelésére.

1.1. Az LV+5 FU után adott uridin (U) jelentősen méréskelte ezen kombináció súlyos myelotoxicitását minden fentebb említett paraméter vonatkozásában. A plazma U szintjét szintén növelő és emberekben biztoságosabban alkalmazható uridin difoszfoglükóz (UDPG) hasonló kedvező hatásokat mutatott; ennek jelentőségét tovább növeli, hogy az UDPG elérhető humán felhasználásra – más indikációban – elfogadott gyógyszerként is.

1.2. LV+5 FU után naponta adott filgrastim, egy G CSF készítmény, javította a neutropeniából való felépülést. U és filgrastim kombinációja hatásosabb volt az erősen myelotoxikus LV+5 FU kombináció nem kívánt hatásainak kivédésében, mint U vagy filgrastim önmagában, igen jelentősem mérsékelve az LV+5 FU által indukált neutropeniát; az U-t helyettesítő UDPG hasonló eredményt mutatott. Magyarázat: az U azáltal potenciálta a filgrastim kedvező hatását, hogy növelte az LV+5 FU kezelést túlélő és erre a citokinre reagáló progenitorsejtek számát. Ez a jelenség további vizsgálatokat indokol és hozzájárulhat az LV+5 FU kombináció hatékonyabb klinikai alkalmazásához.

1.3. Irodalmi adatok szerint az 5-etil-2’-dezoxiuridin egerekben fokozta az 5 FU tumorellenes hatását. Mi egerekben az 5 FU myelotoxicitásának fokozódását figyeltük meg, különösen a frakcionált 5 FU adagolás esetén, ami arra utal, hogy főként a myeloid progenitor sejtek késleltetett regenerációja állhat a háttérben.

1. Kifejlesztettünk egy pásztázó-lézer citometrián (LSC) alapuló új módszert a fluoropirimidinekkel szembeni érzékenység meghatározásban feltehetően szerepet játszó két enzim, a TP és a DPD hányadosának direkt és kvantitatív meghatározására szöveti metszetekben. Az LSC-t eredetileg tárgylemezen elhelyezkedő, egymástól jól elkülönülő sejteken történő kvantitatív fluoreszcencia mérésekre fejlesztették ki, de a nagy sejtsűrűség és a sejteknek a vágási síkhoz viszonyított változatos elhelyezkedése, szöveti metszetekben az egyes sejtek detektálását és mérését nagyon nehézkessé és pontatlanná teszi. Ezért mi szöveti metszetek vizsgálatára egy torzításmentes sztereológiai megközelítést – az LSC „phantom contouring” funkcióját – alkalmaztunk, ami a metszetek külöböző régióinak fluoreszcencia intenzitását pontosabban képes jellemezni. Ez a módszer új távlatokat nyithat annak az elgondolásnak a tanulmányozásához, hogy különféle marker enzimek vagy egyéb proteinek parallel mérése humán tumorok hisztológiai mintáin hozzájárulhat általában daganatellenes szerek, illetve különösen a fluoropirimidinek individualizált használatához.

2. Az LSC fentebb említett tulajdonságai kiterjeszthetők a tumor metasztázis képződés egy korai eseményének, a tumorsejtek megtapadásának vizsgálatára, feltéve, hogy minimális számú tumorsejt könnyedén azonosítható nagyszámú normál sejt között. A zöld fluoreszcens fehérje („green fluorescent protein” = GFP) külöböző eredetű tumorsejtek hasznos markere lehet, ezért mi egy GFP-pozitív sejteket detektáló LSC alapú módszert dolgoztunk ki, melynek szenzitivitása 1:104. Ezt a szenzitivitást egy olyan metódus alkalmazásával értük el, amelyben a detektálási küszöböt a GFP negatív sejtpopulációban detektált legmagasabb fluoreszcencia szint fölé állítottuk be, ezzel nagyon specifikusan elkülönítve a GFP pozitív sejteket a GFP negatívoktól, amelyek szintén relatíve nagy autofluoreszcenciát mutattak a detektálás hullámhosszán. Ez a szenzitivitás is alkalmas lehet GFP-vel jelölt sejtek detektálására és ezzel egyidejűleg több különféle marker mérésére megtartott anatómiai struktúrák mellett, ami más jelenleg elérhető módszerrel nem lehetséges. A ritka tumor sejtek identifikálásnak és az LSC azon képességének kombinációja, hogy alkalmas a tumorsejtekben vagy a környező sejtekben levő egyéb jelölt markerek kvantitatív vizsgálatára, ígéretesnek látszik a sejtek megtapadásnak vizsgálatára.