Development of cytometric methods for the detection of genetic and epigenetic changes

A tétel rövid nézete
dc.contributor.advisorSzabó, Gábor
dc.contributor.authorImre, László
dc.contributor.departmentMolekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskolahu
dc.contributor.submitterdepDE--Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
dc.date.accessioned2019-06-20T12:39:21Z
dc.date.available2019-06-20T12:39:21Z
dc.date.created2019hu_HU
dc.date.defended2019-06-28
dc.description.abstractÚj citometriai módszereket dolgoztam ki genetikai és epigenetikai kérdések megválaszolására: (A) rövid DNS régiókban bekövetkező hossz-változások, illetve DNS szekvenciabeli eltérések detektálására, (B) nukleoszóma stabilitás in situ mérésére, valamint (C) nukleoszómákkal asszociált epigenetikai módosítások analízisére. (A) Az áramlási citometriás platformra épülő genetikai teszt sztreptavidint hordozó mikrogyöngyök felszínén immobilizált és fluoreszcensen jelölt PCR termékek Tm analízisén alapul. A módszer felhasználhatóságát, érzékenységét a Huntington chorea hátterében álló triplet expanzió, illetve a BRCA1 gén egyik pontmutációjának kimutatásával demonstráltam. (B) A pásztázó lézermikroszkópos (citometriás) platformra épülő nukleoszóma stabilitást vizsgáló in situ módszer a hisztonok sókezelés vagy interkalátorral történő kezelés hatására bekövetkező, kromatinról történő disszociációjának mérésén alapul. A sókezelés a nukleoszómák ionerősség-függő, az interkalátor kezelés a nukleoszómák DNS szuperhelicitás-függő stabilitásának mérését teszi lehetővé, hiszton PTM ill. hiszton variáns specifikus módon. A módszert különböző hiszton PTM-ek, illetve a H2A.Z, H2A.X és γH2A.X hiszton variánsok összehasonlító vizsgálatára használtam fel. Kimutattam, hogy a kromatin relaxációja (nick-ek létrehozásával) nukleoszóma destabilizációt okoz, amelynek jelentős szerepe lehet a DNS hozzáférhetőségének epigenetikai szabályozásában. A ≥10 kb távolságban létrehozott nick-ek általi relaxáció már elégségesnek bizonyult a nukleoszómák többségének destabilizációjához, ami azt mutatja, hogy a bevitt nick-ek hatása nem lokális, a relaxáció tovaterjed kromatin hurok méretű távolságokra. A módszerrel végezhető megfigyelések potenciális biológiai jelentőségét mutatja a H2A.Z reader protein nukleoszóma stabilitást befolyásoló funkciójának kimutatása is. (C) Az áramlási citometriás és pásztázó lézermikroszkópos citometriás platformra épülő epigenetikai teszt izolált, mikrogyöngyökön immobilizált mononukleoszómák epigenetikai módosítás kombinációinak analízisén alapul. Ez a mérési elv alkalmasnak bizonyult nick-ekhez közeli, iniciáló ill. elongáló RNS-polimeráz II molekulák ill. R-loop-ok differenciális detektálására. Általános konklúzióként megállapítható, hogy a citometriás analízisre épülő és a molekuláris biológiai metodikák előnyös kombinációi alapvető genetikai és epigenetikai kérdések megválaszolására, gyakorlati problémák megoldására kínálnak új, még kevéssé kiaknázott lehetőségeket.hu_HU
dc.description.abstractNovel cytometric methods were developed for genetic and epigenetic analyzes: (A) for the detection of certain genetic alterations of the length or in the sequence of short genomic regions, (B) for the in situ evaluation of nucleosome stability and (C) for the “ChIP-on-beads” analyzes of nucleosome-associated epigenetic modifications. (A) The flow cytometry assay I developed to address genetic diseases is based on the melting point analyzis of PCR products carrying biotin and a fluorescent moiety on their two ends, and are immobilized on streptavidin-coated microbeads. The efficacy and sensitivity of the method is demonstrated in the case of CAG triplet expansion in Huntington’s disease and a BRCA1 point mutation. (B) The laser scanning cytometric assay I developed for the purposes of in situ evaluation of nucleosome stability is based on the elution of histones using intercalators or salt, so as to assess stability features dependent on DNA superhelicity or electrostatic interactions, respectively. The assays can be preformed on a PTM or histone variant dependent manner. The utility of the method is demonstrated via the comparative analyzes of different histone PTMs and histone variants, including H2A.Z, H2A.X and its phosphorylated form, γH2A.X. It was also demonstrated that DNA relaxation (by nicking) destabilizes nucleosomes, what underscores the powerful potential of topological relaxation in the epigenetic regulation of DNA accessibility. Notably, nicking at ≥10 kb intervals is sufficient to induce global nucleosome destabilization, demonstrating that relaxation is propagated along most of the nucleosomes of the relaxed chromatin loops. The novel observations of biological significance I made employing this method include the demonstration of the nucleosome destabilizing effect of a reader protein in the case of H2A.Z. (C) The cytometric assays developed for the “ChIP-on-beads” analyzes of nucleosome-associated epigenetic modifications are based on the measurement of PTM combinations on isolated mononucleosomes immobilized on microbeads. This experimental system proved useful also for the differential detection of initiating and elongating RNA Pol II molecules and R-loops juxtaposed with nicks. As a general, methodical conclusion, suitable combinations of cytometric approaches with molecular biological methodology can offer a novel outlook on a wide variety of genetic and epigenetic questions of both practical and fundamental biological importance, with many potentialities yet to be exploited.hu_HU
dc.description.correctorde
dc.format.extent109hu_HU
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2437/269904
dc.language.isohuhu_HU
dc.language.isoenhu_HU
dc.subjectflow cytometryhu_HU
dc.subjectáramlási citometriahu_HU
dc.subjectMMA
dc.subjectmelting temperature
dc.subjectHuntington
dc.subjectBRCA
dc.subjectnick
dc.subjectR-loop
dc.subjectChIP
dc.subjecthistone PTM
dc.subjecthistone variant
dc.subjectlaser scanning cytometry
dc.subjectnucleosome stability
dc.subjecthistone eviction
dc.subjectsuperhelicity
dc.subjectmikrogyöngy assay
dc.subjectolvadási hőmérséklet
dc.subjectHuntington
dc.subjectegyszálú folytonosság hiány
dc.subjectR-hurok
dc.subjecthiszton módosítás
dc.subjecthiszton variáns
dc.subjectlézer pásztázó citometria
dc.subjectnukleoszóma stabilitás
dc.subjecthiszton lejövetel
dc.subjectszuperhelicitás
dc.subject.disciplineElméleti orvostudományokhu
dc.subject.sciencefieldOrvostudományokhu
dc.titleDevelopment of cytometric methods for the detection of genetic and epigenetic changeshu_HU
dc.title.translatedCitometriás módszerek fejlesztése genetikai és epigenetikai változások detektálásárahu_HU
Fájlok
Eredeti köteg (ORIGINAL bundle)
Megjelenítve 1 - 4 (Összesen 4)
Nem elérhető
Név:
Imre_Laszlo_tezis_angol.pdf
Méret:
1.04 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
angol tézis
Letöltés
Nem elérhető
Név:
Imre_Laszlo_tezis_magyar.pdf
Méret:
1.08 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
magyar tézis
Letöltés
Nem elérhető
Név:
Imre_Laszlo_meghivo.pdf
Méret:
35.64 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
meghívó
Letöltés
Nem elérhető
Név:
Imre_Laszlo_kiegeszitett_ertekezes.pdf
Méret:
5.68 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
értekezés
Letöltés
Engedélyek köteg
Megjelenítve 1 - 1 (Összesen 1)
Nem elérhető
Név:
license.txt
Méret:
1.93 KB
Formátum:
Item-specific license agreed upon to submission
Leírás:
Letöltés
Gyűjtemények
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola