A biológiai gyógyszerek, vagy más néven bioterápiás készítmények napjainkban egyre nagyobb teret hódítanak a gyógyszerpiacon. Ezek a készítmények a rekombináns fehérjék széles skáláját ölelik fel, úgy mint a különböző hormonok, vérkészítmények, növekedési faktorok, antitest alapú termékek, fúziós proteinek vagy rekombináns oltóanyagok. Számos olyan rekombináns fehérjealapú gyógyszer van jelenleg a piacon, melyek szabadalmai napjainkban lejárnak, megnyitva ezzel a lehetőséget a konkurens cégek számára, hogy kifejlesszék a saját változataikat, amelyeket biohasonlónak, vagy más néven bioszimilárisnak hívunk. A bioszimilárisok olyan másolatai a már jóváhagyott biológiai gyógyszereknek, amelyek átfogó, összehasonlító vizsgálatok alapján hasonlóságot mutatnak az eredetivel fizikai-kémiai tulajdonságaikban, hatékonyságukban és biztonságosságukbank az innovátor termékhez viszonyítva, de nem teljesen azonosak vele. Az eredeti vagy más néven innovátor és biosszimilárisa közötti különbségek abból adódnak, hogy bizonyos információk az eredeti termék gyártásával kapcsolatban nem hozzáférhetőek vagy hiányosak, ezért a gyártás egyes aspektusai eltérhetnek az innovátor gyártási technológiájához képest. Ennek okán előre meghatározott biohasonlósági kritériumok hivatottak foglalkozni olyan kérdésekkel, mint a kis eltérésekkel szembeni érzékenység, valamint a hasonlóság mértékének megállapítása. A legtöbb rekombináns fehérje készítmény (pl. monoklonális antitestek, fúziós fehérjék, stb.) beleértve a biohasonló gyógyszereket is, általában glikolizált. Ezért a glikoziláció egy kritikus minőségi attribútum, amely alighanem az egyik legnagyobb kihívást jelentő bioszimilaritást befolyásoló jellemző. A bioszimilárisok glikozilációja erősen befolyásolhatja a készítmény biológiai aktivitását, stabilitását, farmakokinetikai profilját, felezési idejét, effektor funkcióit és immunogenitását. A glikozilációnak kiemelt jelentősége van a monoklonális antitestek két fő effektor funkciójára, az antitest-függő sejt közvetített citotoxicitásra (ADCC) és a komplement függő citotoxicitásra (CDC) nézve. Munkám során először egy olyan ortogonális analitikai módszeren (CGE-LIF) alapuló mennyiségi kiértékelést fejlesztettem ki, amellyel bioterapeutikumok N-glikán profiljában található CQA relevanciával bíró cukorszerkezetek pontos mennyiségei könnyen meghatározhatók. Ennek bemutatására az adalimumabterápiás fehérjét használtam fel, melyhez különböző mennyiségben adtam Man5 cukorstandardot. Az elektrokinetikus injektálás paramétereinek kombinációjával definiált injektálási együttható és a csúcsterületek között nagy pontosságú (R2=0.9990) lineáris összefüggés mutatkozott. Ezenkívül vizsgáltam a koncentráció hatását a csúcs alatti területekre, melynél szintén nagyon akkurátus (R2=0.9995) exponenciális összefüggést kaptam. Mindezek alapján megállapítottam az adalimumab mintában lévő eredeti Man5 mennyiségét. A következő lépésben az etanercept nevű fúziós fehérje innovátor és bioszimiláris verziójának mennyiségi összehasonlítását végeztem el, melyhez a relatív csúcsterületeket használtam. Kezdetben exoglikozidázos emésztéssel azonosítottam az etanercepthez kapcsolódó N-glikánokat, majd meghatároztam az elválasztás hőmérsékleti optimumát. Ezután megállapítottam, hogy ugyan nincs minőségbeli eltérés a két N-glikozilációs mintázat között, azonban az egyes struktúrák eltérő mennyiségben vannak jelen. Továbbá, a glikoszimilaritási index elméleti megfontolási alapján összehasonlítottam a relatív csúcsterületeket a mennyiségi kiértékeléshez. A glikoszimilaritás kiértékelésénél az általánosan elfogadott ±20% toleranciaküszöböt alkalmaztam. A mindkét verzióban legnagyobb mértékben kifejeződő mag-fukozilált biantennáris glikán (FA2) CDC modulátori szereppel bír, amely nem képezi részét a hatásmódnak, azaz nem tekinthető glikoszimilaritási kritériumnak. A bioszimiláris profilján megfigyelhető az erősen galaktozilált cukorszerkezetek markáns jelenléte (+130 és +124%), viszont glikoszimilaritás szempontjából ezeknek sincs relevanciája. A monogalaktozilált és oligomannóz glikánok nagyon hasonló arányban vannak jelen az innovátorral összehasonlítva (+7 és +10%) (−13 és +19%). Végezetül, annak érdekében, hogy a kapilláris elektroforézisre kifejlesztett analitikai módszerek és kiértékelések nagy mintaszámra is alkalmazhatók legyenek a gyakorlatban, fukozilált biantennáris, afukozilált biantennáris, oligomannóz, valamint bi-, tri- és tertaantennáris α(2-3), illetve α(2-6) irányultságú sziálsavas glikánkönyvtárakat analizáltam multikapilláris elektroforézis készülékkel. Maltooligoszacharid létra és a GUcal szoftver segítségével új glükózegység adatbázist hoztam létre, melynek segítségével multikapilláris elektroforézis készülék alkalmazásával pontosabb kiértékelhetőség valósítható meg. Az adatbázis felállítása után a glikánkönyvtárakkal és maltooligoszacharid létrával együtt analizált terápiás antitestek (etanercept és adalimumab) N-glikánjait azonosítottam. A doktori munkám során megvalósított módszerfejlesztési stratégiával a CQA relevanciával bíró cukorstruktúrák gyors és egyszerű analízise valósítható meg, ahogy azt egy innovátor termék és bioszimilárisa esetén elvégeztem. A nagy mintaszámra történő alkalmazás kifejlesztése megnyitja a lehetőséget az ipari és klinikai laboratóriumok számára a glikozilációs mintázatok összevetését egy ortogonális módszer alkalmazásával.

Biological drugs, also known as biotherapeutics, are increasingly gaining market share in the pharmaceutical industry. These products encompass a wide range of recombinant proteins, including various hormones, blood products, growth factors, antibody-based products, fusion proteins, and recombinant vaccines. Currently, there are a great number of recombinant protein-based drugs on the market whose patents are expiring, thus opening new opportunities for competing companies to develop their own versions, referred to as biosimilars. Biosimilars are copies of already approved biological drugs that demonstrate similarity to the original in their physicochemical properties, efficacy, and safety based on comprehensive comparative studies, although they are not identical to the innovator product. The differences between the original, or innovator, and its biosimilar arise since certain manufacturing details related to the original product are inaccessible or incomplete, leading to potential variations in manufacturing aspects compared to the innovator’s technology. Therefore, predetermined biosimilarity criteria are designed to address issues such as sensitivity to minor deviations and determining the degree of similarity. Most recombinant protein therapeutics, including monoclonal antibodies, fusion proteins, and biosimilars, are typically glycosylated. Hence, glycosylation is a critical quality attribute that presents one of the most challenging characteristics influencing biosimilarity. The glycosylation of biosimilars can significantly affect the product’s biological activity, stability, pharmacokinetic profile, half-life, effector functions, and immunogenicity. Glycosylation is crucial for the two main effector functions of monoclonal antibodies: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC). In the course of my work, I first developed a quantitative evaluation method based on an orthogonal analytical technique (CGE-LIF), which can be used to easily determine the exact amounts of CQA-relevant sugar structures in the N-glycan profile of biotherapeutics. To accomplish this aspect of the task, I utilized adalimumab, to which I added different amounts of Man5 sugar standard. I found a highly accurate (R2=0.9990) linear relationship between the peak area values and the injection coefficient defined by the combination of electrokinetic sample introduction parameters. I also examined the effect of concentration on peak areas, and the result also defined a very accurate (R2=0.9995) exponential relationship. The amount of original Man5 in the sample was calculated based on my results. In the next step, instead of a monoclonal antibody a fusion protein (etanercept) was analyzed. I performed a quantitative comparison of the innovative and biosimilar version utilizing CGE-LIF, for which I used the calculated relative peak area values. Initially, I identified the N-glycans associated with etanercept by exoglycosidase digestion mediated sequencing, then determined the temperature optimum of the separation. I found no profile difference between the two N-glycan pools, but the individual structures were present in different amounts. Based on the theoretical considerations of the glycosimilarity index, I compared the relative peak area values for quantitative evaluation. When evaluating glycosimilarity, I used the generally accepted tolerance limit of ±20%. A core-fucosylated biantennary glycan (FA2) was expressed to the greatest extent in both versions, however, this structure has a CDC modulatory role, which is not part of the mode of action, i.e., it cannot be considered as glycosimilarity criterion. The biosimilar profile showed the abundance of highly galactosylated sugar structures (+130 and +124%), but these were not relevant from the glycosimilarity point of view. Monogalactosylated and high-mannose glycans were present in very similar amounts compared to the innovator (+7 and +10%) (−13 and +19%). Finally, in order to ensure that the analytical methods and evaluations I developed for capillary electrophoresis can be applied to high throughput screening, fucosylated biantennary, afucosylated biantennary, high-mannose, in addition bi-, tri- and tertaantennary α(2-3) and α(2-6) sialylated glycan libraries were analyzed with a multicapillary electrophoresis device. By utilizing maltooligosaccharide ladder and the GUcal software, I generated a new glucose unit database, creating the opportunity for a more accurate evaluation using the multicapillary electrophoresis system. After establishing the database, I identified the N-glycans of the relevant therapeutic antibodies (etanercept and adalimumab) by analyzing them together with the existing glycan libraries and the maltooligosaccharide ladder. During my doctoral work, I developed a method that allows for the rapid and straightforward analysis of sugar structures associated with Critical Quality Attributes (CQAs). This method, demonstrated with both an innovator product and its biosimilar version, offers potential for application to a large number of samples and provides industrial and clinical participants with an opportunity to compare glycosylation patterns using an orthogonal analytical method.