Az endoteliális nitrogén monoxid szintáz (eNOS) számos kardiovaszkuláris funkció szabályozásában fontos szerepet játszik. Az eNOS aktivitásának szabályozásában a Thr495 oldalláncon történő gátló foszforiláció kitüntetett szereppel bír. Munkánk során különböző biokémiai és molekuláris biológiai technikák alkalmazásával kimutattuk, hogy a miozin foszfatáz (MP) holoenzim, amely egy protein foszfatáz-1 (PP1c) katalitikus és egy MP regulátor alegységből (MYPT1) áll, az eNOSpT495 oldalláncot defoszforilálló foszfatáz. Foszfatáz gátlószerek alkalmazása csökkentette a NO képződést valamint az endotél barrier funkciót, amely az erek homeosztázisának fenntartása szempontjából kulcsfontosságú. Ezzel ellentétben, az (-)-epigallokatekin-3-gallát (EGCG) kezelés protein kináz A (PKA) által mediált protein foszfatáz 2A (PP2A) aktivációt eredményezett. Ennek hatására növekedett a MP aktivitása és csökkent az eNOSpThr495, valamint a 20 kDa molekulatömegű miozin II könnyűláncot (MLC20) a pThr18/pSer19 foszforilációs szintje, amely az endotél sejtek kontraktilis apparátusának relaxációját idézte elő. Az endotél sejtek barrier funkciójának elvesztése az erek permeabilitásának növekedéséhez vezet, amely gyakran súlyos következményekkel jár. Kimutattuk, hogy a két barrier protektív vegyület, az adenozin (Ado) és ATPγS különböző jelátviteli útvonalakon fejtik ki hatásukat a HLMVEC sejteken. Az ATPγS a P2Y4 és P2Y12 receptorok közvetítésével cAMP független útvonalon PKA aktivációt idéz elő, amely a ppMLC20 foszforilációs szintjének csökkenéséhez vezet. Ezzel szemben az Ado indukálta endotél barrier funkció növekedéséhez a PKA és EPAC1 koordinált cAMP függő aktivációja szükséges. Eredményeink kulcsfontosságú endotél fehérjék receptor-mediált foszforilációs-defoszforilációs folyamataira, valamint ezek szabályozásában szerepet játszó kinázok, foszfatázok és jelátviteli útvonalak szerepére derítenek fényt.

The importance of eNOS to cardiovascular homeostasis has been well established. A major regulator of the activity of eNOS is post-translational phosphorylation and in particular the inhibitory phosphorylation at Thr495. Using various biochemical and molecular biological techniques we have demonstrated that the myosin phosphatase (MP) holoenzyme, comprised of protein phosphatase-1 catalytic subunit (PP1c) and the MP target subunit-1 (MYPT1), is a bona fide eNOSpThr495 phosphatase. Furthermore, phosphatase inhibitors were shown to suppress NO production and decrease barrier function, both of which are important functions in ECs. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) treatment induced protein kinase A (PKA) -dependent activation of protein phosphatase-2A (PP2A) which increased MP activity. Activated MP dephosphorylated both eNOSpThr495 and the 20 kDa myosin II light chains at Thr18/Ser19 (ppMLC20) which resulted in relaxation of ECs. Loss of EC barrier integrity results in increased vascular permeability, which often has severe consequences including the flooding of alveolar space that occurs in pneumonia. We have shown that adenosine (Ado) and ATPγS, two EC barrier protective agents, exert their profound barrier protecting effects on HLMVEC via distinct signaling mechanisms. ATPγS induced P2Y4 and P2Y12 mediated cAMP independent PKA activation, resulting in MP activation and ppMLC20 dephosphorylation. However, Ado-induced strengthening of the HLMVEC barrier required the coordinated activation of PKA and EPAC1 in cAMP-dependent manner. In summary our studies shed light on the receptor-mediated phosphorylation-dephosphorylation of key endothelial proteins and identified kinases and phosphatases as well as the signaling pathways implicated in these modifications.