Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez
Általános Orvostudományi Kar
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
(vezető: Dr. Csernoch László)
Orvostudományi doktori tanács
D42
tudományág:
-elméleti orvostudományok
Doktori programok:
- Jelátviteli folyamatok sejt- és molekuláris biológiája
(programvezető: Dr. Virág László) - Membránbiofizikai kérdések és vizsgálómódszerek
(programvezető: Dr. Szöllősi János) - Élettan és neurobiológia
(programvezető: Dr. Csernoch László)
Böngészés
legfrissebb feltöltések
- TételSzabadon hozzáférhetőNövényi hatóanyagok vizsgálata akut hasnyálmirigy-gyulladás egérmodelljébenAz akut hasnyálmirigy-gyulladás (AP) növekvő gyakorisága, potenciálisan életveszélyes lefolyása és szövődményei miatt világszerte nagy kihívást jelent az egészségügyi rendszerek számára. Speciális célzott kezelési módok nem állnak rendelkezésre, ezért új utak és új terápiás megközelítések azonosítására kell törekedni. Az alkilamidok és flavonoidok a biológiailag aktív vegyületek számos csoportját foglalják magukban, amelyeknek széles körű hatásai vannak. A spilantolt (alkilamid) és tricetint (flavonoid) még nem vizsgálták hasnyálmirigy-gyulladásban, de az irodalomban található beszámolók sokféle biológiai aktivitásukat, köztük gyulladáscsökkentő hatásukat más betegségmodellekben is kimutatták. Jelen tanulmányban a spilantol (SLT) és a tricetin (TCT) lehetséges terápiás hatásait tanulmányoztuk akut hasnyálmirigy-gyulladásban. A tricetin védelmet nyújtott az izolált primer acinussejteknek a CCK-analóg cerulein citotoxikus hatásával szemben. A szer szignifikánsan csökkentette a sejtekben az oxidatív stressz hatására kialakult PARiláció mértékét. A TCT hatásai valószínűleg nem kapcsolódtak a szer antioxidáns hatásához, mivel gyökfogó aktivitása ellenére nem nyújtott védelmet a H2O2 által kiváltott acináris sejthalállal szemben. Az IL1β, IL6 és a mátrix metalloproteináz 2 (MMP2) cerulein által kiváltott expresszióját a TCT kezelés szintén szignifikánsan csökkentette. Az in vivo kísérletek során a tricetin gátolta a hasnyálmirigyben az ödéma képződését, valamint megvédte a sejteket a pusztulástól. A TCT ezen felül gátolta az IL1β, IL6 és TNFα expresszióját a hasnyálmirigy szövetben, és csökkentette az oxidatív DNS-károsodást, amit a poli(ADP-ribóz) polimeráz 1 (PARP1) enzim termékének, a PAR szintjének csökkenése jelzett. A spilantol in vivo vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a szer szignifikánsan csökkentette a gyulladásos ödémát és a szöveti granulocita infiltrációt, de nem nyújtott védelmet a ceruleinnel kezelt egerek hasnyálmirigy acinussejtjeinek pusztulásával szemben. Adataink arra utalnak, hogy a tricetint potenciális adjuváns kezelési lehetőségként érdemes lehet figyelembe venni az AP terápiájában.
- TételSzabadon hozzáférhetőAdenozin receptor 2A kölcsönható fehérjék funkcionális vizsgálataAz A2AR-függő jelátvitel a makrofágokban kulcsszerepet játszik a gyulladás szabályozásában. A sejtfelszíni A2AR-ok szabályozzák a pro-inflammatorikus citokinek és kemokinek termelését, valamint az immunsejtek proliferációját és differenciálódását. Jelenlegi ismereteink szerint az A2AR C-terminális doménje és a vele kölcsönhatásba lépő fehérjék szabályozzák a receptor újrahasznosítását. Makrofágokban két A2AR kölcsönható partnert sikerült azonosítani, a CtsD proteázt és az NPC1 fehérjét, amelyek hatással lehetnek az A2AR kifejeződésére és aktivitására. Vizsgálataink azt igazolták, hogy az A2AR a CtsD szubsztrátja, valamint a CtsD aktivitásának gátlása növeli az A2AR mennyiségét és sejtfelszíni megjelenését makrofágokban. Az NPC1 és a teljes hosszúságú A2AR közötti kölcsönhatást vizsgáltuk a receptort tartósan expresszáló HEK-293 sejtekben és az A2AR-t endogén módon expresszáló RAW 264.7 makrofág sejtekben. Az A2AR aktiválása csökkenti az NPC1 mRNS és fehérje expresszióját LPS-aktivált egér peritoneális makrofágokban. Az A2AR stimulálása negatívan befolyásolja az NPC1 plazmamembrán irányú transzportját az LPS-stimulált makrofágokban. A LAMP2 és az EEA1 lizoszóma és endoszóma markerek expressziója és lokalizációja is megváltozott az A2AR aktiváció hatására makrofágokban.
- TételSzabadon hozzáférhetőA vázizom rianodin receptorának Ca2+-függő és gyógyszeres szabályozásaA megfelelő sejtműködés fenntartásához elengedhetetlen az intracelluláris kalciumion koncentráció ([Ca2+]IC) precíz szabályozása. A szabályozás fontos eleme a szarkoplazmás retikulum (SR) Ca2+ csatornája, a rianodin receptor (RyR), ami számos sejttípus [Ca2+]IC-nak a megemelésében szerepel. Fontosságát jól mutatja, hogy a RyR genetikai hiánya az élettel összeegyeztethetetlen, pontmutációi pedig olyan rendellenes csatornaműködést eredményeznek, amely szívritmuszavarokhoz, izomgyengeséghez, vagy éppen fokozott izomtónushoz, malignus hipertermia szindrómához (MHS) vezethetnek. Ezeket a kórképeket összefoglaló néven rianopátiáknak nevezzük. Munkánk során azt próbáljuk megérteni, hogy a RyR működését érintő, molekuláris szintű elváltozások hogyan függenek össze a vázizmokat és a szívet érintő tünetekkel, és hogy ezek a kóros folyamatok gyógyszeres terápiával hogyan fordíthatók vissza. Az irodalomban elfogadott tény, hogy ha a kardiomiociták SR Ca2-töltöttsége meghalad egy bizonyos küszöbértéket, akkor a szívizom típusú RyR (RyR2) diasztoléban megnyílik, ami aritmiák kialakulásához vezet. Jelenleg azonban nem tisztázott, hogy a vázizom típusú RyR (RyR1) pontmutációi miatt kialakuló leggyakoribb kórkép – az MHS – hátterében szintén hasonló molekuláris mechanizmus áll-e. Ezért vizsgálataim ennek kiderítésére irányultak. Az MHS a mutáns RyR1-ek illékony altatógázokkal szembeni halálos kimenetelű, túlérzékenységi reakciója. A legelterjedtebb nézet szerint a rianopátiák közös jellemzője a RyR SR [Ca2+]-ja iránti túlérzékenysége, de az ezzel kapcsolatos eredmények ellentmondásai miatt a hipotézis MHS esetén ellenőrzésre szorult. Az ellentmondások oka a SR lumen felé néző Ca2+-kötőhelyek szelektív vizsgálatának nehézsége, ugyanis a Ca2+ a RyR pórusán keresztül a citoplazmatikus oldalra átjutva az ott található Ca2+-kötőhelyeken keresztül is befolyásolhatja a csatorna működését, ami megnehezíti a luminális kötőhelyek szerepének elkülönítését. A probléma áthidalása érdekében a RyR Ca2+ általi szabályozásának vizsgálatára a Ca2+ helyett egy másik specifikus, de impermeábilis ligandot, az Eu3+-t használtuk, ami a RyR Ca2+-kötőhelyeinek oldalszelektív vizsgálatát tette lehetővé, így az MHS kórélettani folyamatának részleteit segített tisztázni. Az egyetlen, MHS krízisben alkalmazható forgalomban lévő gyógyszer a nem-depolarizáló izomrelaxáns dantrolen, aminek a klinikai bevezetése az MHS miatti halálozások számát látványosan lecsökkentette. Bár a szert 1967 óta használják, pontos hatásmechanizmusa részleteiben máig tisztázatlan. A RyR1-hez való specifikus kötődését már régen igazolták, a hatásával kapcsolatos tudományos bizonytalanság oka az a régi megfigyelés, hogy míg intakt vázizomrostokban a dantrolen RyR1-specifikus módon képes gátolni a Ca2+-felszabadulást, a csatornafehérje tisztításával és mesterséges lipid membránba építésével a dantrolen iránti érzékenység látszólag elvész. Munkánk során feltártuk az érzéketlenség okát és megmutattuk, hogy a dantrolen általi gátláshoz Mg2+ és ATP együttes jelenléte szükséges.
- TételSzabadon hozzáférhetőA poli(ADP-ribóz) polimeráz enzimek szerepének karakterizálása pikkelysömörbenA PARP1 és a PARP2 az ADP-ribozilációt, a fehérjék poszttranszlációs módosításainak egyik típusát katalizáló enzimek családjába tartozik. Katalitikus funkciójuk elsődlegesen DNS törések hatására aktiválódik, és így a PARP1 és PARP2 sokáig csak a DNS-törések hibajavításában betöltött kulcsfontosságú szerepéről volt ismert. PARP aktivációt leírtak már számos Th2-mediált gyulladásos folyamatban, de a vizsgálatok főként a PARP1 szerepére koncentráltak, míg a PARP2 gyulladásban betöltött szerepéről kevés információval rendelkezünk. A psoriasis (pikkelysömör) az egyik leggyakoribb krónikus gyulladásos bőrbetegség, amelynek során a bőrön jellegzetes plakkok alakulnak ki az epidermális keratinociták túlzott mértékű proliferációjának és elégtelen differenciációjának következményeként. A jelenleg elfogadott magyarázat szerint a pikkelysömör kialakulásáért a Th sejtek bizonyos populációi, elsődlegesen a Th17 sejtek által mediált immunválaszok felelősekk, amelynek közvetítésében az IL23/IL17 citokin tengelynek központi szerepe van a psoriasis-ra jellemző gyulladás kialakulásában. Munkánk során a PARP1 és a PARP2 lehetséges szerepét kívántuk feltárni a psoriasis-ra jellemző gyulladás szabályozásában. Vizsgálatainkat mind psoriasisos betegek szövetmintáit felhasználva, mind egér modellek alkalmazásával, mind pedig sejtkultúrás kísérleteket használva valósítottuk meg. Eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a PARP1 ellentétes szerepet tölthet be a Th17 típusú gyulladásban, például pikkelysömörben, mint a Th2-mediált folyamatokban, valamint feltételezzük, hogy a PARP2 expresszió és az epidermális keratinociták ösztrogén szintézise között összefüggés lehet, amely hozzájárulhat a lokális gyulladásos folyamatok szabályozásához a pikkelysömör patomechanizmusa során.
- TételSzabadon hozzáférhetőMagreceptorok kölcsönhatásainak vizsgálata kvantitatív fluoreszcencia mikroszkópiás eszközökkelA magreceptorok szupercsaládjába olyan transzkripciós faktorok tartoznak, melyek ligandfüggő módon képesek célgénjeik átírására. Az általunk vizsgált reténsav (RAR) és D-vitamin receptoroknak (VDR) szerepe van olyan folyamatokban, mint a sejtek növekedése, fejlődése és halála. A rexinoid receptornak (RXR) központi szerepe van a magreceptorok működésében, mivel heterodimerizáló partnerként szolgál számos magreceptor, köztük az RAR és VDR számára is. A magreceptorok működését a molekuláris kapcsoló modell írja le. A modell értelmében ezek a magreceptorok agonista ligand hiányában kromatinhoz kötődve gátolják célgénjeik átírását. Agonista ligand hatására konformációváltozás történik, mely során koaktivátorokat kötve a transzkripciós gépezet aktiválását idézik elő. A magreceptorok működését leíró viszonylag statikus molekuláris kapcsoló modellt a területen zajló intenzív kutatások eredményeképpen egyre dinamikusabb kép kezdi felváltani. Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiai (FCS) vizsgálataink arra utalnak, hogy a magreceptoroknak két eltérő mobilitású populációja van jelen a sejtmagban: a gyors populáció rövid ideig kötődik a kromatinhoz, ez felelhet meg a kromatint pásztázó egydimenziós mozgásnak. Ezzel szemben a lassú populációba tartozó magreceptorok hosszabb ideig kötődnek a kromatinhoz, feltehetően specifikus módon a válaszadó elemekhez. Agonista ligandkezelés vagy RXR kotranszfekció hatására RAR esetében a lassú populáció aránya jelentősen növekedett, mely a kromatinhoz történő erősebb kötődés, a kromatinhoz kötött állapot meghosszabbodásának következménye lehet. Ezzel szemben VDR esetében a lassú populáció aránya csak ligand és RXR együttes hozzáadása mellett növekedett, vagyis a VDR kromatinkötése csak ligandkötött állapotban, RXR-rel heterodimert képezve stabil. Három magreceptort (RAR, VDR, RXR) egy sejtben vizsgálva kimutattuk, hogy az RAR és a VDR versengése az RXR kötődéséért a kromatinkötés szintjén is megjelenik, ami felelőssé tehető a magreceptorokon ható humán terápiák mellékhatásaiért. Ligand hiányában az RXR az RAR-t preferálja a VDR-rel szemben, ligand jelenlétében pedig mindig a ligandkötött receptor képezett heterodimert az RXR-rel. Munkám második fázisában továbbfejlesztettünk egy mikroszkópos módszert, mely lehetővé tette, hogy a sejt egy adott síkjában egyidőben vizsgáljuk a molekulák diffúziós tulajdonságait, valamint a közöttük lévő kölcsönhatásokat. A SPIM-FRET-FCCS módszert használva lehetővé vált a magreceptorok dimerizációjának és komobilitásának egyidőben történő mérése, valamint a magreceptor populációk diffúziós paramétereinek meghatározása a sejt egy adott síkjában. A két módszer kombinálásával lehetőség nyílt olyan interakciók megfigyelésére, melyek vizsgálata FRET (Förster rezonancia energia transzfer) vagy FCCS (fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópia) külön-külön történő alkalmazásával félrevezető eredményt adott volna. Alternáló gerjesztés (ALEX) bevezetésével tovább finomítottuk módszerünket, ezáltal csökkent a fluoreszcens fehérjék kiégése és jelentősen javult az FCCS dinamikus tartománya és érzékenysége is. A jelen disszertáció eredményei a későbbiek folyamán segíthetnek a magreceptorok működését befolyásoló terápiás célpontokat találni, valamint felhívják a figyelmet a magreceptorokat célzó terápiák esetében a kompetíció fontosságára. Az általunk kifejlesztett új mikroszkópos módszer más fehérjék esetében is segíthet a molekuláris kölcsönhatások és mobilitás feltérképezésében.