Feszültségkapuzott ioncsatornák funkcionális vizsgálata, implikációk aritmia mechanizmus karakterizálására

Abstract

Munkám során különböző, vad típusú és mutáns, feszültségkapuzott K+ és Na+ csatornák biofizikai karakterizálását végeztem el celluláris elektrofiziológiai vizsgálatok révén. Célom egyrészt a szívizomban kifejeződő, gyors, feszültségfüggő nátriumcsatornát (Nav1.5) kódoló SCN5A gén mutációival összefüggő, genetikailag meghatározott aritmia entitások molekuláris mechanizmusának feltárása, illetve a C-típusú inaktiváció molekuláris mechanizmusában szerepet játszó tényezők azonosítása révén a folyamat jobb megértése volt. Kutatásom első részében a feszültségfüggő káliumcsatornák C-típusú inaktivációját stabilizáló, szelektivitási filter mögé bejutó, úgynevezett „inaktivációs vízmolekulák” által kialakított hidrogénkötés-hálózat jelenlétére kerestem kísérleti bizonyítékokat. Ennek céljából munkacsoportunk korábban a nehézvíz inaktivációt lassító hatását vizsgálta, mely feltételezésünk szerint specifikus molekuláris kölcsönhatások révén jön létre. Ezen specifikus hatások bizonyítása direkt árammérésekkel lehetetlen, így az aspecifikus hatások kizárásával ezt indirekt módon kívántuk megtenni. Munkám során a Shaker-IR csatornákon végzett mérések segítségével a nehézvíz magasabb viszkozitásának inaktivációt lassító hatását sikeresen kizártam, mely tovább erősíti a feltevést, hogy a nehézvíz, és ennek megfelelően a normál víz is bejut a szelektivitási filter mögé, stabilizálva a C-típusú inaktivációt. Kutatásom második részében egy Brugada-szindrómával diagnosztizált betegnél felfedezett új mutáció teljes biofizikai karakterizálását végeztem el. A klinikai diagnosztikus algoritmust követően az azonosított R893C mutációt CHO és HEK sejtekben kifejezve patch-clamp technikával bizonyítottam annak patogén voltát, majd farmakológiai vizsgálatok és konfokális mikroszkópia segítségével feltártam a funkcióvesztés egy lehetséges mechanizmusának molekuláris részleteit, továbbá igazoltam a DII S5-S6 régió és bizonyos konzervált arginin oldalláncok kiemelt jelentőségét a csatornaműködés szempontjából. In our present study, we performed biophysical characterization of various wild-type and mutant, voltage-gated potassium and sodium channels through cellular electrophysiological studies. Our goal was to explore the molecular mechanisms of genetically determined arrhythmias associated with mutations in the SCN5A gene, encoding the cardiac, fast, voltage-dependent sodium channel (Nav1.5), and on the other hand, to better understand the process of C-type inactivation by identifying the factors involved using patch-clamp technique. In the first part of our research, we were looking for evidence of the presence of a hydrogen bond network formed by „inactivation water molecules” behind the selectivity filter, that stabilize the C-type inactivation. For this purpose, our research group previously examined the inactivation slowing effect of heavy water on voltage-gated potassium channels, which we hypothesized to be caused by specific molecular interactions. Proving these specific effects through direct current measurements is impossible, so we aimed to do this indirectly by excluding nonspecific effects. In my work, through measurements conducted on Shaker-IR channels, I successfully ruled out the effect of heavy water's higher viscosity on slowing inactivation, which further strengthens the hypothesis that heavy water, and consequently normal water, enters behind the selectivity filter, stabilizing C-type inactivation. In the second part of our research, we performed full biophysical characterization of a novel mutation discovered in a Brugada syndrome patient. After the clinical diagnostic protocol, we performed genealogical study and genetic testing, then expressed the detected mutation in CHO and HEK cells and confirmed its pathogenicity through patch-clamp studies. Subsequently, through confocal microscopy and pharmacological studies, we uncovered the molecular details of the loss of channel function, further confirming the critical importance of the DII S5-S6 region and certain conserved Arginine residues in channel function.