Immunfehérjék sejtfelszíni mintázatának jellemzésére alkalmazható mintaelőkészítési eljárások fejlesztése transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz

Abstract

A sejtfelszíni fehérjék által kialakított mintázatok kutatása már régóta vizsgált terület a biológiai tudományokban. Számos kutatás eredményeképpen összefüggésbe lehet hozni a fehérjeklasztereket és tulajdonságaikat több sejtfunkcióval. Többek között az adaptív immunválasz első lépése a T-sejt-receptorokat (TCR) kifejező T-sejtek és az antigénprezentáló sejtek (APC) által kifejezett, peptiddel telített Humán Leukocita Antigén (HLA) kölcsönhatása. A munkánk első részében az vizsgáltuk, hogy hogyan tudnánk minél pontosabb leírást adni a sejtfelszíni molekulák eloszlására hagyományos transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) felhasználásával, illetve a módszer alkalmazása releváns biológiai rendszereken, egy pontosabb leíróstatisztikai függvény, a pár-, és a keresztpárkorrelációs függvény (PCF, PCCF) alkalmazásával. Az első kísérleteimbe, a PCF és PCCF függvények segítségével arra a következtetésre jutottam, hogy a KIT 225 FT7.10 sejtvonal sejtfelszínén kifejeződő IL-2R és IL15R receptorok homo- és hetero-asszociációt mutat. A kezdeti kísérleteinkben számos probléma merült fel a TEM minta-előkészítési eljárásban, főként a vizsgálandó terület nagyságának korlátozottsága. Ezért egy új TEM mintaelőkészítési protokollt fejlesztettem ki, amely kiküszöbölte a korábbi hiányosságokat. Az új mintaelőkészítési eljárás segítségével megvizsgáltam a humán JY sejtvonalon kifejeződő HLA I és II típusú sejtfelszíni fehérjék mintázatát. Vizsgálataim eredményeképpen következtetéseket vonhattam le, hogy a vizsgált receptorok több különböző méretű klaszterekben rendeződve jellennek meg a sejtfelszínen. Az új TEM minta-előkészítési protokollt alkalmazva, bekapcsolódtam a munkacsoportunkban már zajló vizsgálatokba, melynek célja volt, hogy a Bare Lymphocyte Syndrome (BLS-1) és ezen sejtvonal transzfekcióját követően (tDQ6-BLS-1), az addig rajta nem kifejeződő HLA II megjelenése hogyan befolyásolja a korábban is kifejeződő HLA I eloszlását, illetve milyenek az egymáshoz képesti proximitás viszonyai. Eredményeim szerint, egyrészt az HLA I és HLA II molekulák hasonló mintázatot mutattak a JY és a tDQ6-BLS-1 sejtvonalakon, ugyanakkor a JY sejteken az HLA I és HLA II klaszterek részben keverednek, addig a tDQ6-BLS-1 sejtvonalon ezek a szegregálódnak. The study of patterns formed by cell surface proteins has long been an area of interest in biological sciences. As a result of numerous studies, it has been possible to relate protein clusters and their properties to several cellular functions. Among others, the first step of the adaptive immune response is the interaction of T cells expressing T-cell receptors (TCR) and peptide-saturated Human Leukocyte Antigen (HLA) expressed by antigen-presenting cells (APC). In the first part of our work, we investigated how we could provide a more accurate description of the distribution of cell surface molecules using traditional transmission electron microscopy (TEM), and the application of the method to relevant biological systems, using a more accurate descriptive statistical function, the pair- and cross-pair correlation function (PCF, PCCF). In my first experiments, using the PCF and PCCF functions, I concluded that the IL-2R and IL15R receptors expressed on the cell surface of the KIT 225 FT7.10 cell line show homo- and hetero-association. In our initial experiments, several problems arose in the TEM sample preparation procedure, mainly the limitation of the size of the area to be examined. Therefore, I developed a new TEM sample preparation protocol that eliminated the previous shortcomings. Using the new sample preparation procedure, I examined the pattern of HLA type I and II cell surface proteins expressed on the human JY cell line. As a result of my studies, I could draw conclusions that the examined receptors are displayed on the cell surface in clusters of several different sizes. Using the new TEM sample preparation protocol, I joined the studies already underway in our working group, the aim of which was to investigate how the appearance of HLA II, which was not expressed on Bare Lymphocyte Syndrome (BLS-1) and this cell line after transfection (tDQ6-BLS-1), affects the distribution of previously expressed HLA I, and what are the proximity relationships to each other. According to my results, on the one hand, HLA I and HLA II molecules showed a similar pattern on the JY and tDQ6-BLS-1 cell lines, but on the JY cells, the HLA I and HLA II clusters are partially mixed, while on the tDQ6-BLS-1 cell line they are segregated.