Summary Human malignant melanoma is one of the most aggressive forms of skin cancer with an exceptionally bad prognosis. Melanoma often display constitutively activated MAPK pathway through BRAF or NRAS mutations. It is also known that these mutations are almost never simultaneously present and that they appear at early stages and preserved throughout tumor progression, although it is proved that these alterations alone are insufficient to cause tumor progression. Therefore the first aim of our study was to evaluate those distinct genetic alterations which can properly differentiate the three important molecular subtypes of primary melanomas with a) BRAF, b) NRAS mutation andc) WT (wild type for both loci). Mutation analysis in the BRAF and NRAS oncogene was performed by melting curve analysis using fluorescent probes. High-resolution array comparative genomic hybridization (array CGH) was used to assess genome-wide analysis of DNA copy number alterations. Based on our array CGH data primary melanomas with BRAF mutation exhibited more frequent losses on 10q23-q26 and gains on chromosome 7 and 1q23-q25 compared to melanomas with NRAS mutation. Loss on the 11q23-q25 sequence was found mainly in conjunction with NRAS mutation. Hierarchical cluster analysis revealed that the presence of BRAF mutation is associated with deletion pattern on 10q chromosome and is frequently observed in lesions with advanced clinical stages. Based on these results we proved the existence of marked differences in the genetic pattern of the BRAF and NRAS mutated melanoma subgroups that might suggest that these mutations contribute to malignant melanoma in conjunction with distinct cooperating oncogenic events. In general, it is an interesting phenomenon suggesting that these mutations provide probably the ‘guiding force’ for these tumors and it also suggests that there are alternative genetic pathways to melanoma. These additional oncogenic events which are associated with BRAF or NRAS mutations can provide rational additional targets for a combination therapy with kinase inhibitors. In this study we also investigated the specific dynamic activities among different signaling pathways highlighted the frequent alterations of genes involved in the signaling interactions between the MAPK-JAK pathways in BRAF mutated melanomas. Using Random Forest analysis we also found a gene alteration signature in the MAPK pathway that was commonly related to the presence of the BRAF mutation in our melanoma cohorts. The second aim of this study was to develop an accurate Q-PCR method for determining the co-amplification pattern of six candidate genes that reside in the 11q13 amplicon core. We found that coamplification of these candidate genes or the CCND1 amplification along with either BRAF or NRAS mutations might be more important for prognosis than the presence of these alterations alone.

Összefoglalás A malignus melanoma az egyik legagresszívabb bőrdaganat, melyek jelentős része rendkívül rossz prognózissal jellemezhető. A melanomák többségében a MAP-kináz útvonal konstitutívan aktiválódik, melyet az NRAS vagy BRAF onkogének mutációja okoz a melanomák tumorigenezisének korai fázisában. Ezen mutációkról már leírták, hogy a daganat progresszió során végig fennmaradnak. A mutációk jelenlétének és prognosztikai jelentőségének eddigi vizsgálatai viszont kimutatták, hogy ezeknek a mutációknak egyedüli jelenléte viszont még nem elegendő a daganatok kialakulásához. Vizsgálataink során kiemelt figyelmet szenteltünk a BRAF és NRAS mutációt hordozó primer melanomák jellegzetes molekuláris eltéréseinek megismerése. A teljes genom eltéréseinek analízisére array-CGH-et alkalmaztunk. A mutációk jelenlétét floureszcensen jelölt oligonukleotid próbák segítségével, olvadáspont analízissel vizsgáltuk. A BRAF-mutációt hordozó daganatokban a leggyakoribb eltérések az 1-es kromoszóma hosszú karjának, illetve a teljes 7-es kromoszómának a DNS-többlete és a 10-es kromoszóma hosszú karjának DNS-hiánya voltak. Az NRAS-mutációt hordozó daganatokra a 11q22.3-11q25 régióban gyakran előforduló deléció volt jellemező. Hierarchikus klaszter analízisünk szerint a 10-es kromoszóma hosszú karjának deléciója szignifikánsan gyakrabban fordul elő BRAF mutációt hordozó és előrehaladott stádiumban lévő primer daganatokban. Eredményeink alapján feltételezhetjük, hogy annak ellenére, hogy az NRAS és a BRAF onkogének aktivációs mutációi ugyanazon szignáltranszdukciós útvonalat aktiválják, a primer melanomák tumorigenezise során eltérő genetikai alterációkkal kooperálnak. Ez a melanoma progresszió során tapasztalt jelenség rendkívül figyelemre méltó, hiszen arra utalhat, hogy a BRAF és NRAS mutációk egyfajta vezérlő erőként funkcionálnak az alternatív genetikai útvonalakat feltételező melanomagenezis során. Eredményeink elemzése során a különböző szignál transzdukciós útvonalak részletesebb vizsgálatával felderítettük, hogy a BRAF mutációt hordozó daganatokban leggyakrabban a MAPK-JAK szignalizációs útvonalak közötti interakcióban résztvevő fehérjék génjei sérülnek majd Random Forest analízis segítségével azonosítottunk további BRAF mutációval összefüggésbe hozható gyakori gén kópiaszám eltéréseket a MAPK útvonalból. Valamint részletesen tanulmányoztuk a 11q13 amplifikációs régió géneltéréseit, melyet korábbi CGH vizsgálataink során a melanoma egyik leggyakoribb genetikai eltéréseként azonosítottunk. Eredményeink arra utalnak, hogy a 11q13 régióban lokalizálódó onkogének ko-amplifikációja, a BRAF vagy NRAS mutáció együttes előfordulása a CCND1 emelkedett géndózisával társulva gyakrabban jellemző rossz prognózisú daganatokra, mint ezen genetikai eltérések jelenléte külön-külön.