A humán transzglutamináz 2 RNS-kötő sajátságának felismerése és megerősítése

Abstract

A transzglutamináz enzimcsalád leginkább tanulmányozott tagja, a szöveti transzglutamináz (TG2), ami egy multifunkcionális fehérje. Többféle enzimaktivitással rendelkezik, illetve számos biológiai folyamatban (pl. jelátvitel, sejtek adhéziója, apoptózis) szerepelhet. A TG2 pontosabb fiziológiás szerepének megállapításához a humán, immortalizált HUVEC sejtvonalat alkalmaztuk, ami természetes körülmények között nagy mennyiségben expresszálja a vizsgálni kívánt fehérjét. A TG2 interaktomot feltárni kétféle megközelítést alkalmaztunk. Az egyikben egy helyspecifikusan biotinilált rekombináns TG2-t használtunk Neutravidin agaróz gyöngyhöz immobilizálva, aminek segítségével a HUVEC sejtkivonatból kifoghattuk a TG2 interakciós partnereit. A másik módszerben olyan HUVEC sejtvonalat fejlesztettünk ki, amiben a TG2 fehérjét csendesítettük, majd egy transzgén TG2 fehérjét expresszáló vektor bevitelével helyreállítottuk (TG2-KD+3F-TG2). A Flag-tag segítségével anti-FLAG M2 agaróz gyöngyhöz kötöttük a TG2-t a vele asszociált fehéréjékkel együtt. LC-MS/MS analízist követően a két módszerrel összesen 356 fehérjét sikerült azonosítani, melyeket informatikai adatbázis (STRING) segítségével elemeztünk. A detektált egyedi peptidek száma alapján a legjobban dúsuló GO Molekuláris funkciók között volt a Sejtadhézió és az RNS-kötés. A TG2 szerepe a sejtadhéziós folyamatokban már bizonyított, azonban RNS-függő folyamatokban való részvételét még nem vizsgálták. A HUVEC sejtekben meghatározni az RNS-kötő fehérjéket OOPS technikát alkalmaztunk. LC-MS/MS analízist követően 413 RNS-kötő fehérjét sikerült azonosítani a detektált, egyedi peptidek száma alapján, melyek között a TG2 fehérje is szerepelt. Az interaktom vizsgálat során azonosított fehérjékkel összehasonlítva, 150 db fehérjetalálat (42 %) volt mindkét esetben detektálva, ami megerősítette a TG2 fehérje szerepét az RNS-fehérje komplexek működésében. A TG2 RNS-kötő képességének bizonyítására mágneses pull-down módszert alkalmaztunk. Az eredmények alapján a TG2 fehérje képes kötődni az RNS molekulához, a TG2 nyitott konformációban történő stabilizálásakor. Valószínűleg zárt konformációs állapotban az RNS-kötő felszínek rejtve vannak a TG2 szerkezetében. Bioréteg interferometriás kísérletben meghatároztuk a TG2-RNS kötés affinitását, ami 88 nM volt. Ez az érték sejtes környezetben valószínűleg még magasabb is lehet biológiailag releváns RNS molekulákkal. A TG2 fehérje RNS-kötő sajátosságainak pontosabb megismeréséhez a TG2 fehérje szerkezetének alaposabb tanulmányozása, az RNS-kötőhelyek feltérképezése, biológiailag releváns RNS célpontok azonosítása szükséges. The most studied member of the transglutaminase enzyme family is tissue transglutaminase (TG2), which is a multifunctional protein. It has multiple enzymatic activities and may be involved in numerous biological processes (e.g., signal transduction, cell adhesion, apoptosis). To determine the precise physiological role of TG2 in endothelial cells, we used the human immortalized HUVEC cell line, which expresses the TG2 protein in large amounts under natural conditions. Two approaches were used to explore the TG2 interactome. In one approach, a site-specifically biotinylated recombinant TG2 immobilized on Neutravidin agarose resin was used to capture TG2 interaction partners from HUVEC cell extracts. In the other method, we developed a HUVEC cell line in which the TG2 protein was silenced and then restored by introducing a vector expressing a transgenic TG2 protein (TG2-KD+3F-TG2). Using the Flag tag, we bound TG2 together with its associated proteins to anti-FLAG M2 agarose resin. Following LC-MS/MS analysis, a total of 356 proteins were identified using the two methods, which were then analyzed using databases (STRING, PANTHER). Based on the number of unique peptides detected, the most enriched GO Molecular Functions were Cell Adhesion and RNA Binding. The role of TG2 in cell adhesion processes has already been proven, but its involvement in RNA-dependent processes has not yet been investigated. The OOPS technique was used to identify RNA-binding proteins in HUVEC cells. Following LC-MS/MS analysis, 413 RNA-binding proteins were identified based on the number of detected unique peptides, including the TG2 protein. Compared to the proteins identified in the interactome study, 150 protein hits (42%) were detected in both cases, confirming the role of the TG2 protein in the functioning of RNA-protein complexes. We used a magnetic pull-down method to demonstrate the RNA-binding ability of TG2. Based on the results, the TG2 protein is able to bind to the RNA molecule when TG2 is stabilized in an open conformation. It is likely that in a closed conformation, the RNA-binding surfaces are hidden within the TG2 structure. In a bio-layer interferometry experiment, we determined the affinity of TG2-RNA binding to be 88 nM. This value may be even higher in a cellular environment with biologically relevant RNA molecules. To gain a more accurate understanding of the RNA-binding properties of the TG2 protein, it is necessary to study the structure of the TG2 protein in more detail, map the RNA-binding sites, and identify biologically relevant RNA targets.