Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez
Általános Orvostudományi Kar
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
(vezető: Dr. Balogh István)
Orvostudományi doktori tanács
D183
tudományág:
- elméleti orvostudományok
Böngészés
legfrissebb feltöltések
Megjelenítve 1 - 20 (Összesen 127)
Tétel Szabadon hozzáférhető Ösztrogének által kifejtett patofiziológiai és transzkriptomikai változások összehasonlító vizsgálata humán ovárium sejtkultúrákon(2024) Beke-Varga , Alexandra Edit; Szilágyi-Bónizs, Melinda; Varga, Alexandra Edit; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar; Általános Orvostudományi Kar::Humángenetikai TanszékA xenoösztrogének, mint pl. a ZEA (mikotoxin) vagy a BPA (műanyag adalékanyag) a fiziológiás ösztrogénekhez (pl. E2, ösztradiol) hasonló hatás kifejtésére képesek, ezáltal növelhetik egyes hormonfüggő daganatok, tk. a petefészekrák kialakulásának a kockázatát. Munkánk során célunk a ZEA és a BPA hatásának az összehasonítása volt a fiziológiás E2 által kiváltott változásokkal humán ovárium sejtvonalak (PEO1 [ERα+] és A2780[ERα-]) felhasználásával. Transzkriptomikai analízisünk alapján ezen molekulák alacsony dózisban több, a sejtproliferációhoz és RNS metabolizmushoz köthető gén indukcióját okozták, mely hatás az E2 és a ZEA esetében hangsúlyosabbnak bizonyult, mint a BPA alkalmazásakor. Emellett sikerült azonosítanunk 27 miRNS-t, melyek szintén elmozdulást mutattak a kezelések hatására, és feltehetően fontosak lehetnek az ovárium sejtek ösztrogén válaszában. A nagy dózisú E2, ZEA és BPA kezelések ugyanakkor csökkentették a sejtek életképességét és sejthalált indukáltak, mely hatás intenzívebb volt az ERα-val nem rendelkező A2780 sejtvonalban, vagy ha az ezen receptor általi jelátvitelt MPP-vel blokkoltuk a PEO1 sejtvonalban. Ez arra utal, hogy az ERα mediált ösztrogén válasz központi szerepet tölthet be a sejtek proliferációs kapacitásának fenntartásában, ezáltal a sejtek toleranciájának meghatározásában nagy dózisú ösztrogén kezelés hatására. Ugyancsak fontos lehet a PI3K/AKT útvonal működése, ugyanis, ha ezen útvonalat AZD8835, vagy miR-30d-5p mimik alkalmazásával gátoltuk, ugyancsak csökkent a PEO1 sejtek toleranciája. A miR-30d-5p önmagában, vagy tamoxifénnel kombinálva csökkentette a sejtek proliferációs kapacitását, mely felveti ezen molekula alkalmazásának lehetőségét a petefészekrák jövőbeli terápiájában.Tétel Szabadon hozzáférhető EGR2 is an epigenomic regulator of alternative macrophage polarization and a nexus modulator of alveolar macrophage-related antifungal immunity(2025) Kolostyák, Zsuzsanna; Nagy, László; Kolostyák , Zsuzsanna; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi KarKutatásunk az „Early Growth Response 2” (EGR2) transzkripciós faktort szerepét vizsgálja az alternatív makrofág polarizáció szabályozásában csontvelői monocyta eredtű makrofágokban (BMDM) és az alveoláris makrofágok (AM) által betöltött funkciókban. A BMDM-ok képesek különböző makrofág fenotípus irányába differenciálódni. Az EGR2, mint epigenetikus és transzkripciós regulátor, az alternatív makrofág polarizáció késői, stabil szakaszát szabályozza. A szöveti eredetű AM-okban magas az EGR2 kifejeződése. Eredményeink alapján az EGR2 közvetlenül szabályozza a terminális differenciációs géneket, valamint a gomba ellenes válaszban szerepet játszó kulcsfontosságú géneket (pl. Dectin-1). Emellett hiányában zavart szenved a gyulladás feloldása, fibrosis alakul ki. Eredmények bizonyítják az EGR2 központi szerepét a makrofág funkciók finomhangolásában a patogének elleni védekezés és a szöveti regeneráció során.Tétel Szabadon hozzáférhető A humán T-limfotróp leukémia vírus 1, -2 és -3 proteázok biokémiai karakterizálása, valamint dohányfüst toxin és hasnyálmirigy lipáz mutáció, mint krónikus pankreatitisz kockázati tényezők vizsgálata.(2025) Kassay, Norbert; Tőzsér, József; Kassay, Norbert; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Biokémiai és Molekuláris Biológiai IntézetAz első humán patogén retrovírusokat az előző század 80-as éveiben fedezték fel, köztük az 1-es és 2-es típusú humán T-limfotróp vírusokat (HTLV-1, HTLV-2) és az 1-es típusú humán immundeficiencia vírust (HIV-1) is. Ezek közül a legnagyobb figyelmet HIV-1 kapta, mely a szerzett immunhiányos tünetegyüttes (AIDS) betegség kialakulásáért felelős kórokozó. A súlyos megbetegedések a HIV-1 vírussal kapcsolatos kutatások felfutását idézték elő, ezzel elősegítve a HIV-1-ellenes inhibitorok fejlesztését, így mára a HIV-1 fertőzés tünetmentes maradhat. Ezzel párhuzamosan megindultak a HTLV-1 vírussal kapcsolatos kutatások is, amelyek viszont nem zárultak hasonló sikerrel, így a mai napig sincs specifikus terápia az általa kiváltott betegségekre. Az egyik potenciális terápiás támadópont a proteáz, amely a retrovírusok életciklusában esszenciális szerepet tölt be, a HIV-1 ellenes terápiában több proteázgátlót is sikeresen alkalmaznak. A HTLV-2 és HTLV-3 vírusfertőzések kisebb populációkat érintenek, ezért a HTLV-1-nél is kisebb figyelmet kaptak, viszont ezek elterjedése akár egy-egy mutációt követően is gyorsan változhat, ezért szükséges részletesebb vizsgálatuk, így a proteáz tanulmányozása is. A krónikus pankreatitisz egy súlyos, visszafordíthatatlan megbetegedés, amelyet elsősorban az alkoholfogyasztás vagy a dohányzás, valamint kisebb gyakorisággal a pankreász acinus sejtjei által termelődött fehérjékben található mutációk válthatnak ki. A genetikai eredetű megbetegedések hátterében leggyakrabban a kationos tripszin áll, amely inaktív formában szekretálódik az acinus sejtekből, majd a patkóbélben aktiválódik. A korai, pankreászon belüli aktiválódása tünetekkel asszociálható. A tripszin központi szerepet tölt be más emésztőenzimek aktivációjában is. A tripszin, vagy az aktiválandó emésztőenzimek szekvenciájában található egyes mutációk funkciónyerő és funkcióvesztő hatást is okozhatnak, ezért komoly kockázati tényezők lehetnek. A genetikai eredetű megbetegedések másik típusa esetében a betegség kialakulását a pankreász sejtek által termelt fehérjék nem megfelelő feltekeredése okozza. Itt a tripszin nem tölt be központi szerepet és a legtöbb, fiziológiás körülmények között nagy mennyiségben szekretálódó fehérje érintett lehet, így egy általánosabb mechanizmust jelent. Több esetben egy ilyen fehérje jelenléte elegendő a betegség kiváltásához, számos esetben viszont ez nem egyértelműen bizonyított, illetve egészséges egyénekben is kimutathatóak ezek a mutációk. Elképzelhető, hogy a betegség kiváltásához más tényezők is szükségesek, viszont ezzel kapcsolatban még kevés adat áll rendelkezésre.Tétel Szabadon hozzáférhető A plazma C9 epitópok heterogenitásának vizsgálata(2024) Tornyi, Ilona; Takács, László; Tornyi, Ilona; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Humángenetikai TanszékNapjaink technológiai fejlődése lehetővé teszi a fehérjék proteoformáinak egyre részletesebb megismerését, amely hozzájárulhat funkcióik mélyebb megértéséhez és a biomarker alkalmazások bővítéséhez. Korábbi kutatásaink során protein epitóp profilírozással megállapítottuk, hogy a fehérjék epitópjai eltérő módon asszociálnak tüdőrákos plazában az antitestekkel. Ezen vizsgálatok folytatásaként a C9 fehérje epitópjait elemeztük. A QuantiPlasma könyvtárából három anti-C9 antitestet választottunk ki (BSI0449, BSI0581, BSI0639), amelyek eltérő asszociációt mutattak tüdőrákos mintákban (semleges, negatív és pozitív). Az antitesteket Western blottal validáltuk, majd az epitópok függetlenségét vizsgáltuk, amelyek nagymértékben függetlenek voltak egymástól. Tömegspektrometriával kimutattuk, hogy a C9 fehérje peptideloszlása hasonló volt a kontroll és tüdőrákos mintákban, így a szerkezeti eltérések valószínűleg nem magyarázzák az asszociációs különbségeket. A C9 koprecipitált fehérjéit elemezve három eltérést mutató fehérjét azonosítottunk: a C4A erősen asszociált a BSI0449 mintákkal, de hiányzott a BSI0639 tüdőrákos mintákban; a HSP90AB1 a BSI0639 mintákhoz kötődött, de nem volt jelen a BSI0449 mintákban; a HSPA8 kizárólag a BSI0639 mintákban volt jelen. Továbbá, a C9 415-ös pozíciójában N-glikozilációs heterogenitást figyeltünk meg, amelynek aránya jelentősen eltért a kontroll és tüdőrákos minták között a pozitív epitópok esetében. Eredményeink megerősítik, hogy a C9 fehérjének több proteoformája létezik, amelyek eltérő epitópokon keresztül vizsgálhatók. Ezek a proteoformák és a velük koprecipitált fehérjék jelentős biomarker értékkel bírhatnak a tüdőrák diagnosztikájában.Tétel Szabadon hozzáférhető R-hurok regulátorok azonosítása és vizsgálata nagy áteresztőképességű genomikai szűrőmódszerekkel és metaanalízissel(2024) Kissné Boros-Oláh, Beáta; Székvölgyi, Lóránt; Boros-Oláh, Beáta; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi KarPhD munkám középpontjában az R-hurkok és kromatin hurkok vizsgálata állt. Ennek keretén belül farmakogenomikai metaanalízissel vizsgáltuk az R-hurkok szerepét a daganat terápiában. Kifejlesztettünk két új módszert (DRIP-BC-seq, 4C-BC-seq), melyek R-hurkokat, illetve kromatin hurkokat szabályozó gének azonosítására szolgálnak. Továbbá Hi-C módszerrel vizsgáltuk Arabidopsis thaliana modellnövényben az NDX gén hatását a genom térbeli konformációjára. Legfőbb eredményeink: rávilágítottunk arra, hogy az R-hurkokat szabályozó gének számos daganat esetén biomarkerként és terápiás célpontként hasznosíthatók. Módszer fejlesztéseinknek köszönhetően növeltük a potenciálisan R-hurok/kromatin-hurok szabályozó gének listáját, miáltal új utak nyílnak az R-hurok kutatás és az epigenetikai daganatterápiák területén. Továbbá Hi-C eredményeink alapján megállapítottuk, hogy az NDX hiánya elősegíti a 3D kromatin kölcsönhatások létrejöttét a kromocentereken és a transzkripciósan csendes heterokromatinon keresztül. My PhD work focused on the examination of R-loops and chromatin loops. Within this framework, we used pharmacogenomic meta-analysis to study the role of R-loops in cancer therapy. We developed two new methods (DRIP-BC-seq, 4C-BC-seq) for identifying genes regulating R-loops and chromatin loops, respectively. Additionally, we used the Hi-C method to study the effect of the NDX gene on the spatial conformation of the genome in the model plant Arabidopsis thaliana. Our main results: we highlighted that genes regulating R-loops can be used as biomarkers and therapeutic targets in many tumors. Thanks to our methodological developments, we have increased the list of potentially R-loop/chromatin loop regulatory genes, opening new ways in the field of R-loop research and epigenetic tumor therapies. Furthermore, based on our Hi-C results, we found that NDX deficiency promotes the formation of 3D chromatin interactions through chromocenters and transcriptionally silent heterochromatin.Tétel Szabadon hozzáférhető A magyarországi fiatal felnőttkori monogénes diabeteses betegek genetikai és klinikai vizsgálata(2024) Gaál, Zsolt; Balogh, István; Gaál, Zsolt; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Laboratóriumi Medicina Intézet::Klinikai Genetikai TanszékCÉLKITŰZÉSEK Munkánkban a magyarországi MODY betegek vizsgálatára fókuszáltunk az alábbiak szerint: I. A magyar MODY betegek mutáció spektrumának, fenotípusos jellemzőinek felmérése. A MODY altípusok meghatározása. II. A klinikailag előszűrt MODY-gyanúval rendelkező kohorsz esetében a diagnosztikai szenzitivitás meghatározása. III. A genetikailag igazolt MODY betegekben a jelenlegi kezelés elemzése. IV. Kaszkádvizsgálatokkal a veszélyeztetett mutáció hordozó családtagok definiálása. ÖSSZEGZÉS Elsőként vizsgáltunk Magyarországon egy nagy MODY kohorszt. Feltérképeztük a MODY magyarországi spektrumát, megállapítottuk, mely MODY génekben detektálható kóroki eltérés. Számos esetben tünetmentes családtagokat is teszteltünk. A 450 vizsgált betegben 132 esetben igazoltunk kóroki genetikai eltérést. Kaszkád vizsgálatokat végeztünk, melyek során 95 további mutáció-pozitív esetet találtunk, közülük 21 esetben diagnózisunk preszimptómás volt. Megállapítottuk, hogy hazánkban a GCK-MODY a leggyakoribb, melyet a HNF1A- MODY követ, együtt adva az esetek több, mint 90%-át. Részletes elemzésnek vetettük alá a kóroki variánsokat. A GCK génben 65 különböző kóroki variánst írtunk le. Igen magasnak adódott az új, korábban nem ismert mutációk aránya (40%, 28/65). A HNF1A génben összesen 17 kóroki eltérést mutattunk ki, melyek közül kettő új, a szakirodalomban korábban nem szereplő volt. Összesen öt ritka MODY génben detektáltunk kóroki variánst. Ezek közül két új, korábban nem ismert eltérést írtunk le. 2 családnál észleltünk de novo mutációt. A mutáció- pozitív HNF1A-MODY páciensek esetében a diabetes diagnózisa 20 éves átlagéletkorban történt, míg a genetikai megerősítés 12 éves diagnosztikai késedelemmel. A GCK-MODY esetében a diabetes diagnózisa 15 éves átlagéletkorban történt, a genetikai megerősítés 7 éves késedelemmel. Eredményeink igazolják, hogy a MODY genetikai diagnózisa nagymértékben javítja a megfelelő kezeléshez jutást. A két legnagyobb MODY csoport vizsgálatakor kiderült, hogy a betegek 52,5%-a kapja a megfelelő kezelést, míg a betegek 24,4%-a a felesleges és az életminőséget károsan befolyásoló inzulin kezelésben részesült. ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK 1. Elsőként állítottunk fel és vizsgáltunk Magyarországon egy nagy MODY kohorszt. A 450 betegből 132 esetben igazoltunk kóroki genetikai eltérést. Kaszkád vizsgálatok során 95 további mutáció-pozitív esetet találtunk, közülük 21 esetben preszimptómás állapotban. 2. Hazánkban a GCK-MODY a leggyakoribb, melyet a HNF1A-MODY követ, összesen az esetek több, mint 90%-át jelentve. 3. A GCK génben 65 különböző kóroki variánst írtunk le, melyek közül 28 korábban le nem írt eltérés volt. A HNF1A génben 17 kóroki eltérést mutattunk ki, köztük kettő újat. Öt ritka MODY génben detektáltunk kóroki variánst, két új mutációval. 2 családnál észleltünk de novo mutációt. 4. A HNF1A-MODY páciensek esetében a diabetes diagnózisa 20 éves átlagéletkorban történt, míg a genetikai megerősítés 12 éves diagnosztikai késedelemmel. Ezek az adatok a GCK- MODY esetében 15 és 7 évnek adódtak. 5. A magyar kohorsz vizsgálata során igazoltuk, hogy a MODY genetikai diagnózisa javítja a megfelelő kezeléshez jutást. GCK-MODY és HNF1A-MODY esetében a betegek 52,5%-a kapta a megfelelő kezelést, míg a betegek 24,4%-a a felesleges és az életminőséget károsan befolyásoló inzulin kezelésben részesült.Tétel Szabadon hozzáférhető A venezuelai ló-láz encephalitis vírus cisztein proteázának szerkezet-alapú vizsgálata(2024) Hoffka, Gyula; Mótyán, János András; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi KarA venezuelai ló-láz encephalitis vírus (VEEV) egy emberekben is súlyos, esetenként halálos kimenetelű megbetegedést okozó vírus. A vírus életciklusában kulcsszerepet tölt be a nem-szerkezeti fehérje 2 proteáza (nsP2pro), amely a virális poliprotein funkcionális egységekre hasítását végzi, és a gazdasejt egyes, immunválaszban szerepet játszó fehérjéit is képes elhasítani. Jelenleg sincs engedélyezett vakcina vagy antivirális gyógyszer a VEEV fertőzés megelőzésére vagy kezelésére, ezért az nsP2pro fontos gyógyszercélpont, ami indokolja vizsgálatát. Kutatásaink során célul tűztük ki, hogy a VEEV nsP2pro specificitásának és konformációs állapotainak kísérletes vizsgálatához kapcsolódóan elvégezzük a fehérje szerkezetének molekuladinamikai módszerekkel történő vizsgálatát, az in vitro vizsgálatok eredményének értelmezése, valamint a szerkezet-funkció összefüggések meghatározása érdekében. A VEEV nsP2pro szubsztrát-specificitásának kísérletes vizsgálatához kapcsolódóan modelleztük az enzim és az in vitro hasítási reakciókban is alkalmazott szubsztrát komplexét, majd a molekudinamikai módszerekkel ekvilibrált szerkezet vizsgálatával meghatároztuk az egyes szubsztrátkötő helyeken kialakuló enzim-szubsztrát kölcsönhatásokat. A szerkezet számítógépes vizsgálata segítségével feltérképezhettük az egyes szubsztrátkötő helyek aminosav-preferenciáit meghatározó szerkezeti sajátságokat. A VEEV nsP2pro kísérletes vizsgálatának részeként röntgenkrisztallográfiával meghatároztuk a VEEV nsP2pro szerkezetét. A feloldott szerkezetben az enzim egy öninaktivált konformációs állapotát figyeltük meg, melyben az enzim N-terminális régiója az aktív hely irányába fordulva helyezkedett el, elfoglalva a szubsztrátkötő helyet. Munkánk során elvégeztük az aktív és öninaktivált konformációs állapotokat reprezentáló nsP2pro kristályszerkezetek összehasonlító vizsgálatát, továbbá molekuladinamikai szimulációk segítségével vizsgáltuk a VEEV nsP2pro konformációs állapotait. Munkánk eredményeként feltérképeztük az enzim aktív helyén kialakuló kölcsönhatási hálózatokat, meghatároztuk az aktív és inaktív konformációs állapotok sajátságait, valamint az enzim stabilitásában fontos szerepet játszó szerkezeti tulajdonságokat. Eredményeink hozzájárulhatnak a VEEV nsP2Pro specificitását és stabilitását meghatározó szerkezeti sajátságok jobb megértéséhez, és felhasználhatóak lehetnek az enzim gátlását célzó molekulák fejlesztéséhez.Tétel Szabadon hozzáférhető Elhízás-ellenes hőtermelő folyamatok kikapcsolása vagy fenntartása humán bézs adipocitákban(2024) Vámos, Attila; Kristóf, Endre Károly; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Biokémiai és Molekuláris Biológiai IntézetKorábban rágcsáló modellekben kimutatták, hogy a barnulást kiváltó inger megszűnésekor, a parkin-függő mitofágia aktiválódik, és inaktív bézs adipociták jönnek létre. Emberben azonban eddig még nem vizsgálták részletesen a bézsből fehérbe történő átalakulás molekuláris eseményeit. Kísérleteink során a humán primer SC abdominális preadipocitákat 14 napig bézs adipocitává differenciáltattuk, majd vagy a bézs tenyésztési körülményeket alkalmaztuk további 14 napig, vagy fehér differenciációs médiummal helyettesítettük azt. A kontroll fehér zsírsejteket 28 napon át specifikus hormonális koktéllal differenciáltattuk. A PPARγ-vezérelt bézs differenciáció megnövekedett mitokondriális biogenezist, UCP1 expressziót, fragmentációt és légzést eredményezett a fehérhez képest. Az átalakuláson átesett adipociták morfológiája, UCP1-tartalma, mitokondriális fragmentációja és bazális légzése, valamint a mitofágia indukciója nem tért el szignifikánsan a kontroll fehér adipocitákhoz hasonlítva. A bézs-fehér átalakuláson átesett adipociták azonban erősebben reagáltak az adrenerg ingert utánzó dibutiril-cAMP-re, mint a kontroll fehér zsírsejtek. A génexpressziós változások azt mutatták, hogy a mitofágia az átalakuló adipocitákban parkin-függő és -független útvonalakat is magában foglalhat. A bézs adipociták inaktív állapotba kerülésének megakadályozása fenntarthatja a folyamatos, magas termogenezist és energia felszabadítást. RNS-szekvenálást végeztünk a különböző FTO allélokat hordozó adipociták génexpressziós mintázatának vizsgálatára. Kísérleteink során a korábban használt bézs differenciációs protokollt kiegészítettük egy 4 órás 500 µM-os dibutiril-cAMP kezeléssel, mellyel nagyobb termogenikus potenciállal rendelkező aktív bézs adipocitákat kaptunk. Megfigyeltük, hogy a rizikó-mentes TT alléleket hordozó aktív bézs adipociták magasabb barna adipocita tartalommal és barnulási kapacitással rendelkeztek, mint a fehér vagy az inaktív bézs sejtek, azonban az elhízás rizikó CC genotípusúak esetében nem tapasztaltunk hasonló szignifikáns különbséget. Az FTO CC alléleket hordozó aktív bézs adipociták alacsonyabb termogenikus génexpresszióval (például UCP1, PM20D1, CIDEA) és protoncsorgásos légzéssel mért termogenezissel rendelkeztek, mint a TT hordozók. Ezen túlmenően, a CC allélokkal rendelkező aktív bézs adipociták alacsonyabb ASC-1 (SLC7A10 kódolja) semleges aminosav transzporter expressziót és kevesebb Ala, Ser, Cys és Gly fogyasztást mutattak a rizikó-mentes genotípusúakéhoz képest. Az FTO rs1421085 SNP vizsgálata során vizsgáltuk annak kizárólagos és kritikus hatását a zsírsejtek termogenezisre történő aktivációjára, azonban a fehér és az inaktív bézs adipocitákra nem figyeltük meg szignifikáns hatását.Tétel Szabadon hozzáférhető The role of retinol saturase enzyme and adenosine A3 receptor in skeletal muscle development and regeneration(2024) Tarban, Nastaran; Sarang, Zsolt; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi KarFollowing skeletal muscle injury, the regeneration begins with local inflammation, which is accompanied by the removal of dead cells. Phagocytosis of dead cells regulates the inflammatory program in macrophages (Mϕ) by promoting the transformation of inflammatory macrophages into “healing” macrophages. The pro-inflammatory cytokines initiate the activation and proliferation of muscle stem cells, called satellite cells, while growth factors, produced by healing macrophages drive myoblast differentiation, fusion, and myotube growth. Therefore, impaired phagocytosis or inflammation can lead to decreased muscle regeneration. The oxidoreductase enzyme retinol saturase (RetSat) is required for proper Mϕ phagocytosis while A3 adenosine receptor (A3R) was shown to modulate inflammatory responses. Therefore, our aim was to investigate the impact of RetSat enzyme and A3R deficiency on skeletal muscle development and regeneration in mice. Tibialis anterior (TA) muscle damage was induced by intramuscular cardiotoxin (CTX) injection. Muscle fiber cross-sectional area (CSA), collagen deposition, and the extent of tissue necrosis were measured to evaluate the regeneration process. Flow cytometric analysis was used to quantify intramuscular leukocyte infiltration and detect SCs. Gene expression was measured in total muscles and muscle-infiltrating CD45+ cells. In vivo muscle force measurements were used to determine the impact of A3R ablation on physical performance. We found that RetSat ablation did not affect the body and TA muscle weights. In addition, the structure and the fiber size of the regenerating muscles ultimately were similar in both strains. In accordance with the previous findings, the in vitro phagocytosis assay showed lower phagocytic capacity of the Mϕs in RetSat−/− mice. Parallel with this, we detected decreased milk fat globule-EGF factor 8 protein (MFG-E8), arginase 1, and neuropeptide Y expression and increased IL1-β and nitric oxide synthase expression in muscle-derived CD45+ in RetSat−/− mice. There was a decreased CD45+ cell infiltration in the regenerating muscles of RetSat−/− mice. However, the size of the necrotic areas in the regenerating TA muscles was similar between the two mouse strains. In line with this, we detected a robust MFG-E8 expression in the regenerating TA muscles of both strains. A3R ablation did not affect body and muscle weights, but a higher percentage of bigger muscle fibers was detected in fast twitch muscles of A3R−/− mice, as well as decreased muscle strength in mice. There was an increased CD45+ cell infiltration in the regenerating muscles of A3R−/− mice and these mice exhibited a more rapid clearance of necrotic tissue and a reduced collagen 1 deposition during TA muscle regeneration. Moreover, we detected a significantly increased myofiber CSA in the regenerating muscles of A3R−/− mice at day 22 post-injury. We have found that in the RetSat−/− mice, there are multiple compensatory mechanisms between the cells that participate in the skeletal muscle regeneration which ultimately results in normal muscle repair in the absence of RetSat enzyme despite the observed decreased Mϕ function. In the case of adenosine A3R, our data support the role of this receptor as a negative regulator of both injury-related regenerative inflammation and muscle fiber growth in the TA muscle. Consequently, the inhibition of A3R may hold therapeutic promise for enhancing skeletal muscle regeneration after injury.Tétel Szabadon hozzáférhető The role of hypoxia-inducible factor activation in glucose-induced osteo-/chondrogenic differentiation of lens epithelial cells and chronic kidney disease-associated heart valve calcification(2024) Ababneh, Haneen; Jeney, Viktória; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi KarEctopic calcification, particularly vascular calcification and cataract formation are significant health concerns associated with ageing, diabetes, and CKD. Pathological osteo-/chondrogenic transdifferentiation contributes to ectopic calcification, particularly in vascular smooth muscle cells and valve interstitial cells. Studies have indicated an association between osteo- /chondrogenic transdifferentiation and ectopic calcification in both VC and cataract formation with common etiological factors. Type 2 diabetes is associated with a higher prevalence of cataracts. The risk of cataract formation increases with the duration of diabetes and the severity of hyperglycaemia. Hydroxyapatite deposition is present in cataractous lenses and can result from osteo-/chondrogenic transdifferentiation and calcification of the lens epithelial cells. In this study, we investigated the possibility that hyperglycaemia promotes osteo- /chondrogenic transdifferentiation of HuLECs, and we studied whether CKD triggered cardiac tissue calcification. We determined that high glucose levels increased the expression of OMinduced osteo-/chondrogenic markers Runx2, Sox9, ALP, and OCN, and nuclear translocation of Runx2. High glucose-induced calcification was attenuated in Runx2‐deficient HuLECs. Additionally, high glucose levels stabilised the regulatory alpha subunits of hypoxia‐inducible factor 1 (HIF‐1), triggered nuclear translocation of HIF‐1α, and increased the expression of HIF‐1 target genes. Gene silencing of HIF‐1α or HIF‐2α attenuated high glucose‐induced calcification of HuLECs, whereas hypoxia mimetics enhanced the calcification of HuLECs under normal glucose conditions. We have developed a CKD mouse model using adenine and a high-phosphate-containing diet. Serum urea, creatinine, and phosphate levels were elevated thus confirming the success of the diet. This diet led to the calcification of CKD mouse hearts which was visualised using the OsteoSenseTM dye. In addition, we found that the hearts of CKD mice expressed the hypoxia markers HIF-1α and HIF-2α, and the osteo-/chondrogenic markers Sox9 and Runx2. In conclusion, our studies shed light on the importance of HIF-1 pathway activation in soft tissue calcification, which may be relevant in diabetes-induced cataract formation and CKDassociated valve calcification.Tétel Szabadon hozzáférhető Examination of metabolites in human serum, tear as well as wine and wine vinegar samples using mass spectrometry-coupled ultra-performance liquid chromatography(2023) Nokhoijav, Erdenetsetseg; Csősz, Éva; Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola; Általános Orvostudományi KarDiabetes and obesity are pathological conditions affecting millions of people worldwide. Examination of metabolites and of their relation with other clinical parameters can give valuable information on the pathophysiological changes and eventually can lead to identification of new potential biomarkers allowing for a better patient stratification and prediction of complications. We determined the changes in the levels of amino acids and biogenic amines in obesity and T2D as compared to healthy controls, and we have successfully proved already known and demonstrated some new, previously unknown correlations between the levels of amino acids and clinical laboratory parameters and patients data, respectively. The applied network model also provided useful information about the pathways and protein associations that are characteristic to obesity and/or T2D. We acknowledge the need for further research to validate the emerging concepts and gain a deeper understanding of the complex metabolic dysregulation associated with obesity-induced insulin resistance and T2D. Besides serum, tears was also examined, but due to the high variance in the data and the relatively low sample number available, no statistical significances were established between the studied groups. This points out to one of the main limitations of our study, namely the requirement for more donors to enable a better patient stratification and the utilization of tears for diagnostic purposes. Despite these limitations, our results offer valuable information that can serve as potential targets for mechanistic studies aimed at developing future therapies for insulin resistance in advanced obesity and T2D. In our next study we examined the amino acid and biogenic amine concentrations in various grape-derived beverages. The level of amino acids and biogenic amines in Furmint, Aszú, and Essence wines, as well as wine vinegar from the Tokaj wine region was characteristic to the studied beverage, reflecting their different production process. By comparing Aszú-Furmint wine pairs from the same winery and year, we identified some amino acids and biogenic amines sensitive to the presence of botrytized grapes in Aszú. Our experimental setup can provide a relatively fast and easy-to-implement analytical approach for the quality control and nutraceutical examination of wine and wine vinegar.Tétel Szabadon hozzáférhető Mutációs spektrum meghatározása monogénes kórképek esetén új generációs szekvenálási módszerek segítségével(2023) Madar, László; Balogh, István; László; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Általános Orvostudományi Kar::Laboratóriumi Medicina Intézet::Klinikai Genetikai TanszékA bemutatott tanulmányokban különböző új generációs szekvenálási módszerek alkalmazhatóságát és hatékonyságát vizsgáltuk két monogénes kórképben. Mindkét betegség esetén elmondható, hogy a molekuláris genetikai vizsgálati módszerek az elmúlt 10-15 évben teljes mértékben átalakultak. Korábban az eltérések kimutatását célzó genetikai vizsgálat az ismert variánsok esetében célzott vizsgálatot, például restrikciós emésztést jelentett, addig az ismeretlen, nukleotid szintű eltérések kimutatására a költséges és időigényes Sanger féle DNS szekvenálás jelentette az egyetlen lehetőséget. Olyan nagyméretű gének esetében, mint például a 65 kódoló exonnal rendelkező FBN1 ez rendkívül költséges és időigényes volt, hiszen minden egyes exonra meg kellett tervezni a primereket és külön-külön elvégezni a Sanger szekvenálást. Szintén nehezen kivitelezhető volt ez a megközelítés a genetikai heterogenitással rendelkező kórképek esetén, mint például a familiáris hiperkoleszterinémia, mivel a betegség hátterében nemcsak egy, hanem több gén is állhat. Ezen gének mérete pedig szintén kihívást jelentett. Sokáig itt is a variáns specifikus, vagy egy-egy rövid DNS szakasz célzott vizsgálata jelentette a DNS szintű analízist. Ezeket a problémákat küszöbölte ki egyszerre a molekuláris diagnosztikába berobbanó új generációs szekvenáló technikák megjelenése. Immáron nem volt kizáró ok egy gén mérete, illetve az sem, ha egy adott betegség hátterében több gént is vizsgálnunk kell a kóroki eltérés keresése során. Az első tanulmányban 26 egymással rokoni kapcsolatban nem álló egyén genotípus- fenotípus összefüggéseit írtuk le, akik Marfan szindróma vagy egyéb kötőszöveti betegség iránydiagnózisával érkeztek. A vizsgálat során két különböző új generációs szekvenáló platformot és három DNS könyvtárkészítési módszert használtunk. Összesen 23 betegben azonosítottunk valamilyen kóroki vagy potenciálisan kóroki eltérést az FBN1 génben, melyek közül 16 visszatérő variáns volt, 7 eltérést pedig korábban még nem írtak le. Az általunk kimutatott eltéréseket összevetettük az irodalmi adatokkal. Az esetek nagyrészében az FBN1 variánsok Marfan szindrómával társultak, 2 esetben pedig a szindróma súlyos, korai megjelenésű (neonatális) formájával. Marfan szindróma esetén nagy jelentősége lehet a patogén eltérések azonosításának, mivel rendkívül fontos a várható következmények miatt a pontos genotípus-fenotípus összefüggés felismerése. A patogén variáns ismeretében az irodalmi adatok jó támpontot nyújthatnak abban, hogy a várható szövődményeket megelőzzék, illetve késleltessék. Sok esetben szoros kardiológia, szemészeti és ortopédiai követés ajánlott a betegeknek. A súlyos aortaérintettség miatt szintén fontos szerep jut a genetikai diagnózisnak az esetleges műtéti beavatkozások tekintetében. A második tanulmányban a magyarországi familiáris hiperkoleszterinémiás betegek genetikai hátterét igyekeztünk feltérképezni. Mivel a betegség hátterében több gén patogén eltérése is felmerül ezért a kórképpel kapcsolatba hozható géneket vizsgáló kitet használtunk a minták analízisére. Összesen 44 beteg esetében tudtunk kóroki vagy valószínűleg kóroki eltéréseket kimutatni. Hét beteg az APOB, míg 37 beteg az LDLR génben hordozott valamilyen eltérést. Három beteg esetében összetett heterozigóta genotípus igazolódott, mely magyarázta a súlyosabb klinikai tüneteket. Bemutattuk a betegek főbb klinikai paramétereit és a genotípus-fenotípus összefüggéseit. Két-két LDLR és APOB eltérés detektáltunk, melyek korábban még nem kerültek leírásra. A familiáris hiperkoleszterinémia hátterében álló leírt és nem leírt variánsokat összehasonlítottuk az irodalmi adatokkal. Meghatároztuk továbbá egy 1 exont érintő deléció pontos töréspontjait is. A familiáris hiperkoleszterinémia korai felismerése rendkívül fontos. A betegség még mindig rendkívül aluldiagnosztizált és későn vagy egyáltalán nem kerül felismerésre a végzetes kimenetelű kardiovaszkuláris szövődmények miatt. A korai életkorban (főleg gyerekkorban) felismert FH időben elindított lipidcsökkentő kezelése esetlegesen rendelkezésre álló célzott gyógyszerterápia, valamint a diéta és a szoros követés mind hozzájárulhat ahhoz, hogy a betegek jó életminőségben és kisebb kardiovaszkuláris kockázattal élhessenek. Szintén hangsúlyozni szükséges a genetikai tanácsadás fontosságát, hiszen az érintett családtagok felvilágosítása és szűrése kiemelkedő fontosságú a lehetséges szövődmények miatt.Tétel Szabadon hozzáférhető A P-glikoprotein szerkezetének és fehérje interakcióinak vizsgálata keresztkötéses tömegspektrometriával(2023) Gellén, Gabriella; Bacsó, Zsolt; Gellén, Gabriella; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi KarAz ABC transzporterek családjába tartozó P-glikoproteinről (Pgp) ismert, hogy részt vesz a tumorsejtek multidrog-rezisztenciájában. A koleszterin és egyéb lipidek kulcsfontosságú szerepet játszanak a Pgp konformációinak kialakításában, ennek azonban a hagyományos szerkezetbiológiai technikákkal történő tanulmányozása igen körülményes. Kísérleteink során újszerű, robusztus mintaelőkészítési módszereket alkalmaztunk keresztkötéses tömegspektrometriás (XL-MS) analízishez, lehetővé téve a Pgp szerkezetének vizsgálatát, annak természetes lipidkörnyezete megtartása mellett. Két kísérleti megközelítést alkalmaztunk: (i) az élő sejteket kezeltük keresztkötőkkel, majd membránpreparálást követően dúsítottuk a keresztkötött Pgp komplexeket; (ii) a keresztkötést az immunprecipitációs gyöngyökön végeztük a membránpreparálást és dúsítást követően. A keresztkötött komplexeket extracellulárisan kötődő monoklonális Pgp-ellenes antitestekkel dúsítottuk mágneses gyöngyökön, majd a gyöngyök felszínén történt az enzimatikus emésztés. Az LC-MS/MS eredmények alapján azonosított mono-linkek a Pgp oldószer számára hozzáférhető aminosav-oldalláncait segítettek feltérképezni. A Pgp-n belüli keresztkötések megerősítették a fehérje extracelluláris, transzmembrán és intracelluláris szegmensei közötti kölcsönhatásokat, melyekről ismert, hogy koleszterinérzékenyek. Tömegspektrometriás eredményeinket irodalmi adatokkal és molekuladokkolással kiegészítve meghatároztuk a 15D3 koleszterinfüggő monoklonális antitest epitópját. Emellett az azonosított Pgp fehérjepartnerek bizonyítják a Pgp szoros kapcsolatát a citoszkeletonnal és egyéb koleszterin által szabályozott fehérjékkel. Eredményeink azt sugallják, hogy az XL-MS felhasználható fehérjeszerkezet- és hálózatelemzésekre olyan összetett rendszerekben is, mint a membránfehérjék.Tétel Szabadon hozzáférhető Attenuation of phosphate mediated ectopic calcification through the Nrf2/HO-1 axis(2023) Chowdhury, Arpan; Jeney, Viktoria; Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori IskolaIn general, calcification is a common physiological procedure to form bones and cartilage but when this calcification occurs in soft tissues, i.e., is known as an ectopic calcification. Calcific nodules and osteochondrogenic differentiations are the characteristics and of course, it is a pathophysiological condition. It is so far reported in several tissues namely the Kidney, heart, skin, eyes `and brain. In our two different papers, we worked on two different model organs. Statistics showed CAVD affects 13% of the total population above the age of 65. Calcification in the soft aortic valve is known as CAVD. In the picture, we can see the difference between a normal aortic valve and a calcific aortic valve in an open and closed condition. Two major cell populations were found in aortic valves. 1) VICs – valve interstitial cells and 2) VECs- valve endothelial cells. Previous research showed that VICs are more prone to calcify than VECs, so we chose VICs as our research interest. A calcified plaque on the surface of a senile cataractous lens (CL) isolated from a 79-year-old male patient was identified and its chemical composition was quantified using Fourier transform infrared (FTIR) and confocal Raman micro spectroscopies. No previously described mechanism could properly characterize the presence of HA in lens cataracts. Calcification was reported in other areas of the eyes as well like eyelids, sclera, cornea, lens, and retina. The inner structure of the lens consists of lens epithelium cells a cuboidal monolayer. As previous research showed that VICs and HuLECs both can go through the osteogenic transdifferentiation under the stimulation of high phosphate, we tried to see if a strong antioxidant system like the NRF2/HO-1 axis can revert or delay the procedure. NRF2 is a key regulator of the antioxidant system. In normal conditions, it goes through proteasomal degradation by the keap1/cul3 complex in the cytosol. Under stress conditions, it goes to the nucleus binds to the ARE (Anti-oxidant response element), and activates its downstream regulators like HO-1 (Heme oxygenase 1). HO-1 is an enzyme able to deplete heme into equimolar bilirubin through biliverdin, CO, and iron through ferritin. Heme plays a very contrasting role in our physiological system. Free heme can produce lots of ROS on the other hand heme degradation products like iron and bilirubin have anti-oxidant properties as well. So, to understand the bigger and complex picture we used heme as an inducer of the NRF2/HO-1 axis. We found that heme-mediated activation of the Nrf2/HO-1 axis can protect against high phosphate-induced calcification of valve interstitial cells and lens epithelial cells. We also discovered that inhibition of Nrf2 and HO-1 activities altered the protective effect of heme towards the high phosphate-induced calcification of valve interstitial cells and lens epithelial cells. Since iron is indeed the most important among the degradation products of heme in lens calcification, the effect of bilirubin, CO, and iron on valvular interstitial cells is more variegated. The generation of reactive oxygen species (ROS) by heme is important to activate the Nrf2/HO-1 axis in high phosphate-induced calcification of lens epithelial cells. This research, I feel, can contribute to a better understanding of the relationship between CKD, cataracts, and CAVD. Although we show here a beneficial effect of heme against VIC and HuLEC calcification, before we administer heme to patients to prevent calcification (as a form of heme arginate, a drug in use to treat acute porphyrias), we should consider the well-known pro-oxidant and pro-inflammatory nature of heme. We showed here that the beneficial effect of heme relies on the activation of the Nrf2 antioxidant system. Therefore, using other dietary Nrf2 inducers such as curcumin, resveratrol, or sulforaphane could be a safer approach.Tétel Szabadon hozzáférhető A hipoxia-indukált faktor (HIF) jelátviteli útvonal aktivációjának szerepe a billentyű intersticiális sejtek oszteogén differenciálódásában és kalcifikációjában(2023) Csiki, Dávid Máté; Jeney, Viktória; Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi KarA végstádiumú krónikus veseelégtelenségben szenvedő betegek leggyakoribb kardiovaszkuláris szövődménye az aortabillentyű kalcifikációja. A krónikus veseelégtelenség során az ásványi- és csontanyagcserezavar miatt kialakult hiperfoszfatémia és hiperkalcémia az aortabillentyűt felépítő VIC-ek oszteogén irányú fenotípus váltását idézi elő, mely a kalcifikáció kialakulásához vezet. A szöveti hipoxia jelenléte ismert aorta kalcifikációban, viszont pontos szerepe még tisztázatlan. Munkánk során a hipoxia általi HIF jelátviteli útvonal aktivációjának szerepét vizsgáltuk a VIC-ek foszfát és kalcium által indukált oszteogén irányú differenciálódásában és kalcifikációjában. Kimutattuk, hogy a hipoxia HIF-1/2α függő módon fokozza a VIC-ek OM-által indukált oszteogén differenciálódását és az ECM kalcifikációját. A HIF jelátviteli útvonal aktivációjának VIC-ek OM-indukált kalcifikációjában betöltött szerepét bizonyítja, hogy a HIF aktiváció chetominnal, és HIF-1/2a géncsendesítési módszerrel történő gátlása normoxiás körülmények között az kalcifikáció teljes, míg hipoxiás körülmények között a kalcifikáció részleges gátlását eredményezte. A hipoxia és a ROS képződés közötti kapcsolat vizsgálata során megállapítottuk, hogy a hipoxia ROS-függő módon fokozza VIC-ek OM- indukált kalcifikációját, mely antioxidánssal hatékonyan gátolható. A CKD-asszociált anémia kezelésére Japánban 2020 óta az új generációs prolil-hidroxiláz inhibitor DPD-t is alkalmazzák. Kutatócsoportunk korábbi munkája során kimutatta, hogy DPD fokozza a foszfáttal indukált VSMC-k kalcifikációját in vitro, és in vivo CKD egérmodellben, ezért megvizsgáltuk a DPD szívbillentyű kalcifikációra gyakorolt hatását is. Megállapítottuk, hogy a DPD a HIF jelátviteli útvonal aktivációján keresztül fokozza a VIC-ek kalcifikációját, mely a HIF-1/2a együttes géncsendesítése révén gátolható. A DPD kalcifikációra gyakorolt hatását in vivo CKD egérmodellben tovább vizsgáltuk, és megállapítottuk, hogy a DPD a CKD-asszociált anémiát hatékonyan korrigálja, viszont fokozza a szívszövet és szívbillentyű kalcifikációját. A DPD pro- kalcifikációs hatásának ismeretében a betegellátásban történő alkalmazása előtt célszerű körültekintően eljárni. Figyelembe kell venni az anémia súlyosságát, a plazma foszfát és kalcium szinteket és a beteg aktuális kardiovaszkuláris állapotát a nem kívánatos kardiovaszkuláris szövődmények elkerülésének érdekében.Tétel Szabadon hozzáférhető Citoszólikus szenzorok aktivitásának és szabályozó mechanizmusaiknak vizsgálata plazmacitoid dendritikus sejtekben(2023) Bencze, Dóra; Pázmándi, Kitti Linda; Bencze , Dóra; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi KarA NOD-szerű receptorok (NLR) az immunrendszer erősen konzervált citoszólikus mintázat felismerő receptorai (PRR), melyek multifunkcionális tulajdonságuk révén nemcsak a kórokozók és a szöveti sérülések veszély jeleinek felismerésében vesznek részt, hanem a sejt szinte minden funkciójára hatással vannak, kezdve az autofágiától a transzkripció aktivációjáig. Rendkívül fontos tulajdonságuk továbbá, hogy képesek más PRR-ek jelátviteli útvonalait szabályozni, illetve multiprotein inflammaszóma komplexeket képezhetnek, ezzel pedig meghatározhatják mind az antibakteriális, mind az antivirális immunválasz kimenetelét. A plazmacitoid dendritikus sejtek (pDS) szervezetünk professzionális I-es típusú interferon (IFN) termelő sejtjei, melyek nagymértékű IFN termelő képességük révén egyedülálló antivirális aktivitással bírnak, ugyanakkor az autoimmun folyamatok patogenezisében is szerepet játszanak, így fontos terápiás célpontok. Azonban a pDS-ekben a citoszólikus PRR-ek szerepe és szabályozó mechanizmusaik kevésbé feltártak. Így kutatásunk célja az volt, hogy a humán pDS-ekben is megvizsgáljuk a különböző NLR-ek szabályozó receptor interakcióit, illetve az inflammaszóma formáló képességüket. Kimutattuk, hogy az NLRX1 és az NLRC5 negatívan szabályozza a RIG-I-szerű receptorok (RLR) közvetített I-es típusú IFN termelést a pDS-ekben és a monocita eredetű dendritikus sejtekben (moDS) is, míg a pro-inflammatórikus citokin választ csak az NLRX1 gátolja és csak a moDS-ekben. Ezen eredményeink azt mutatják, hogy a sejtspecifikus hatás mellett, a regulatórikus NLR-ek főként azon sejtfunkciók esetében szolgálhatnak negatív visszacsatolási mechanizmusként, melyek jelentős mértékben meghatározzák az adott sejt profilját. Bizonyítottuk továbbá, hogy a regulatórikus NLR-ek mellett az NLRP3 inflammaszóma is funkcionál a pDS-ekben. Eredményeink alapján erős NF-κB induktorokra és specifikus másodlagos, az inflammaszómát aktiváló jelekre is szükség van pDS-ekben a biológiailag aktív, érett IL-1β szekréció kiváltásához. Azonban az NLRP3-függő IL-1β szekréciós útvonal csak olyan gyulladásos körülmények között lehet aktív a pDS-ekben, melyekben az I-es típusú IFN útvonal aktivitás nem dominál, mivel a magas I-es típusú IFN szinttel járó állapotok számos NLRP3 gátló fehérjének az expresszióját fokozzák. Munkánk során tehát sikerült új receptor interakciókat, illetve inflammaszóma aktivitást feltárnunk egy olyan sejttípusban, melynek szerepe számos patológiás állapotban ismert. A pDS-ek és az NLR-ek nem megfelelő működése is lényeges kóroki tényezőnek minősül a fertőzések kimenetelét, illetve az autoimmun folyamatok kialakulását illetően, ezért a pDS-ek citoszólikus receptorainak és szabályozó mechanizmusaiknak átfogóbb megismerése új célpontokkal szolgálhat számos kórkép terápiás eljárásainak hatékonyabbá tételéhez.Tétel Szabadon hozzáférhető Fluoreszcenciás módszerek kidolgozása ABC transzporterek katalitikus ciklusának vizsgálatára és hal hibridek ploiditásának meghatározására(2023) Gyöngy, Zsuzsanna; Goda, Katalin; Katalin; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar::Biofizikai és Sejtbiológiai IntézetA humán ABCG2 és a P-glikoprotein (Pgp, ABCB1) elsődlegesen aktív, exporter típusú ABC transzporterek, melyek számos főként hidrofób vagy amfipatikus xeno- és endobiotikumot képesek eltávolítani a sejtekből, mint például kemoterápiás szereket és toxikus metabolikus melléktermékeket. Tumorsejtekben (ABCG2, Pgp) vagy tumor őssejtekben (ABCG2) expresszálódva multidrog rezisztenciát okozhatnak, mely gyakran hozzájárul a daganatok eliminálását célzó kemoterápia sikertelenségéhez. Mindkét fehérje főként a szervezet barrier-funkciókkal rendelkező szöveteiben expresszálódik, beleértve a vér-agy gátat, a vér-here gátat, a beleket, a májat, a méhlepényt, a veséket és az emlőmirigyeket. Szöveti lokalizációjuk, valamint széles szubsztrát-spektrumuk miatt fontos szerepet játszanak a különböző betegségek kezelésére használt gyógyszerek felszívódásában, szervezeten belüli eloszlásában, eliminációjában és toxicitásában (ADME-Tox). Másrészt a genetikai polimorfizmusok, amelyek az ABCG2 vagy az ABCB1 expressziójának csökkenését és/vagy működésének károsodását eredményezik, megváltozott terápiás választ és a gyógyszeres kezeléssel összefüggő toxikus reakciókat okozhatnak. Mivel az ABCG2 a húgysav eliminációs útvonalának is kulcsszereplője, csökkent expressziója vagy működése hiperurikémiát és köszvényt okozhat. Fiziológiás funkcióik és betegségek patomechanizmusában, valamint a gyógyszer rezisztencia kialakulásában betöltött szerepük miatt fontos gyógyszer célpontok, mely szükségessé teszi működési mechanizmusuk részletes megismerését.Tétel Szabadon hozzáférhető A HIF-1 útvonal aktiváció szerepe a vaszkuláris kalcifikáció patomechanizmusában(2023) Tóth, Andrea; Jeney, Viktória; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi KarA vaszkuláris kalcifikáció egy komplex, a vaszkuláris simaizomsejtek, valamint számos induktor és inhibitor közreműködésével zajló aktív folyamat, melynek során bekövetkezik a vaszkuláris simaizomsejtek oszteokondrogén irányú differenciálódása. A kalcifikációs mikrokörnyezet gyakran hipoxiássá válik, ezért munkánk során a hipoxia hatását vizsgáltuk vaszkuláris simaizomsejtek oszteokondrogén irányú differenciálódására. Kimutattuk, hogy a hipoxia fokozza a vaszkuláris simaizomsejtek hipoxia által indukált HIF-1α és célfehérjéinek, valamint az oszteokondrogenikus markerek expresszióját és az extracelluláris mátrix kalcifikációját. Kimutattuk, hogy a hipoxia fokozza a vaszkuláris simaizomsejtek mitokondriális ROS termelődését. A HIF-1 útvonal chetominnal történő gátlása csökkenti a Vaszkuláris simaizomsejtek hipoxia által indukált oszteokondrogén irányú differenciálódását, az extracelluláris mátrix kalcifikációját és a ROS termelést. Megállapítottuk, hogy ROS szkevendzserek jelenlétében elmaradt a vaszkuláris simaizomsejtek hipoxia által indukált oszteokondrogén irányú átprogramozódása és extracelluláris mátrix kalcifikációja. Ex vivo szövettenyészetben tovább vizsgálódva kimutattuk, hogy a hipoxia fokozza az egér aorta kalcifikációját, mely ROS és HIF-1 inhibitorokkal gátolható. Eredményeink arra utalnak, hogy a hipoxia fokozza a vaszkuláris simaizomsejtek oszteokondrogén irányú differenciálódását, mely hatásban a HIF-1 útvonal aktivációja és a mitokondriális ROS termelődésének fokozódása játszik szerepet. A krónikus vesebetegséghez gyakran társul anémia. A Daprodustat egy prolil-hidroxiláz enzim inhibitor, mely a krónikus vesebetegség-asszociált anémia kezelésére kifejlesztett újgenerációs szerek egyike. Korábbi tanulmányok kimutatták a HIF-1 aktiváció és a vaszkuláris kalcifikáció közötti kapcsolatot, ezért a DPD foszfáttal-indukált kalcifikációt fokozó hatását vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a DPD aktiválja a HIF-1 útvonalat és fokozza a Vaszkuláris simaizomsejtek magas foszfáttal indukált kalcifikációját. A HIF-1 útvonal farmakológiai vagy a HIF-1α expressziójának csökkentése általi gátlása megakadályozza a DPD pro-kalcifikációs hatását. A DPD kalcifikációt fokozó hatását ex vivo egér aorta szövettenyészetben is kimutattuk. A DPD kalcifikációra gyakorolt hatását in vivo körülmények között is vizsgáltuk adeninnel indukált krónikus vesebetegség egérmodellben. Kimutattuk, hogy a DPD kezelés megelőzi az anémia kialakulását CKD egerekben, ugyanakkor fokozza az aorta kalcifikációt. A HIF-1 útvonal aktiváció pro-kalcifikációs hatásának ismerete olyan klinikai tanulmányokat sürget, melyekben az új generációs hipoxia mimetikumok kardiovaszkuláris rizikóra gyakorolt hatása felmérhetőTétel Szabadon hozzáférhető Bioaktív komponensekben gazdag nutraceutikumok hatásának vizsgálata broiler csirke tápcsatorna mikrobiomra újgenerációs szekvenálással(2023) Szilágyi-Tolnai, Emese; Biró, Sándor; Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi KarA mikrobiom tagjai (vírusok, gombák, baktériumok) az egész szervezetet benépesítik, megtalálhatók a felső légutakban, bőrön és a GIT-ben. Alapvetően a legtöbb mikroba a gazdaszervezettel szimbiotikus kapcsolatban él, megvédik a szervezetet a patogén mikroorganizmusok behatolásától, ezenkívül számos más a gazdaszervezet szempontjából hasznos funkciót is betöltenek. A bél-mikrobióta egyensúlya a gazdaszervezet számára számos előnnyel jár, míg egyensúlyának megbomlása számos anyagcserével és immunrendszerrel összefüggő betegség kialakulásához vezet. Noha a bél-mikrobiom funkciója, összetétele alaposan tanulmányozott, az eddigi eredmények csupán részben fedik le e hatalmas területet, számtalan kérdés megválaszolatlan maradt. A bél-mikrobiom működésének a gazdaszervezetre kifejtett hatásának pontos megismeréséhez kiemelkedő fontosságú összetételének alapos ismerete. Napjainkban az új-generációs szekvenáláson alapuló technikák (NGS) alkalmazása egyre nagyobb teret hódítanak a mikrobiális összetétel vizsgálatok során. NGS használatával lehetőségünk nyílik arra, hogy információt kapjunk a klasszikus mikrobiológiával, tenyésztéses módszerrel nem vizsgálható mikroorganizmusokról és azok tulajdonságairól. Azonban a kapott eredményt számos egymást követő módszer összessége határozza meg. Munkám egyik célja volt, hogy meghatározzam a különböző technikai torzító tényezők hatásait a 16 S rRNS gén amplikon szekvenálás eredményére. Két mintahomogenizáló módszert vizsgáltunk a direkt lízist (DL) és a bakteriális sejtszúszpenziót (BS). Kimutattuk, hogy a DL alkalmazásával nagyobb DNS kihozatal érhető el, azonban ezzel a módszerrel gyengébb minőségű DNS-t kaptunk, mint a BS esetében. Megállapítottuk, hogy a BS nagyobb alfa diverzitási és szekvenálási mutató értékeket eredményezett. A DL alkalmazásával nagyobb mennyiségben nyerhetők ki a Gram-pozitív baktériumok, míg a BS esetében kiegyensúlyozott Gram profilokat kaptunk. Összehasonlítottuk a különböző sejtfeltáró és DNS izoláló módszereket. Kimutattuk, hogy a mechanikai és kémiai lízisek kombinációjával érhető el a legnagyobb alfa diverzitási mutató. Eredményeink alapján elmondható továbbá, hogy a kit alapú DNS izolálási módszerek eredményezték a legkonzisztensebb eredményt. A MagNa Pure 24 automatizált platform alkalmazásával nagy mennyiségű és jó minőségű DNS nyerhető ki, standardizálható eljárás, jól alkalmazható mikrobiom összetételben bekövetkező változások nyomon követésére. A konvencionális DNS izolálási eljárással nyertük ki a legnagyobb mennyiségű, azonban legrosszabb minőségű DNS-t. Mindazonáltal ez a módszer kiemelkedőnek bizonyult a mikrobióta közösségek mélyreható elemzésére. Ezzel a módszerrel érhető el a legnagyobb bakteriális diverzitás. Jelenleg a tudományos érdeklődés középpontjában olyan terápiás stratégiák kidolgozása áll, amelyek az állati és emberi bél-mikrobiomot alkotó egyes mikrobákat célozzák meg, ami által az egyensúlyi mikrobiom helyreállítható, illetve fentarthat. Munkám másik fő célja, a különböző bioaktív komponensekben gazdag nutraceutikumok (karotinoidok, fruktooligoszacharidok, szimbiotikumok, antocianinok) és a bél-mikrobióta közötti kölcsönhatások vizsgálata volt broiler csirkében. Megállapítottuk, hogy az állomány fejlődése során lényegesen változott a bél-mikrobiom összetétele. A nutraceutikumok alkalmazása pozitív hatást fejtett ki az állatok bél-mikrobiom diverzitására. Továbbá a nutraceutikumokkal történő kezelés serkentette számos jótékony SCFA termelő baktérium (Bifidobacteriaceae, Subdoligranulum, Faecalibacterium, Akkermansia, Butyricicoccus, Blautia, Ruminococcus) mennyiségét a csirkék bél-mikrobiomjában. Munkánk során számos pozitív és negatív korrelációt sikerült feltárnunk a mikrobiális összetétel és súlygyarapodás között. Kimutattuk, hogy a patogén Campylobacteriaceae, Helicobacteriaceae és Enterobacteriaceae mennyisége csökkent a nutraceutikum kezelést kapott állatok bél-mikrobiomjában. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a nutraceutikum kezelés ígéretes megoldás lehet bizonyos bélbaktériumok túlszaporodásával kapcsolatos egészségügyi problémák leküzdésére és potenciálisan alternatív kezelési stratégiák lehetnek az antibiotikumok alkalmazásának helyettesítésére, csökkentésére. A jövőben a mikrobiom kutatások izgalmas perspektívákat kínálnak mind az állattenyésztési alkalmazások mind a különböző humán patológiás folyamatok (például cukorbetegség, magasvérnyomás, gyulladásos bélbetegség) kezelésének kifejlesztésével szemben. Microbes are present everywhere. Countless symbiotic, pathogenic, and commensal microbes colonize human, animal, and plant organisms, which together constitute the microbiome. The widespread use of next-generation sequencing (NGS) technologies has led to an explosion of interest in understanding the microbiome. With the advent of NGS technologies, it has become possible to comprehensively map the individual members of a given microbiome and to investigate how microbial communities function and influence host-pathogen interactions. The various NGS methods have their own technical pitfalls, which can affect the obtained sequencing results. In the first part of our experiments, we aimed to investigate the effects of various technical distortion factors on the results of 16 S rRNA gene amplicon sequencing. Two sample homogenization methods were investigated direct direct lysis (DL) and indirect bacterial cell suspension (BS). We have shown that a higher DNA yield can be obtained by using DL, however with this method we obtained lower quality DNA than in the case of BS. We found that BS resulted in higher alpha diversity and sequencing index values. Gram-positive bacteria can be recovered in larger amount using DL, while balanced Gram profiles were obtained in the case of BS. We compared different cell lyses and DNA isolation methods. We have revealed that the combination of mechanical and chemical lysis achieves the highest alpha diversity index. We observed that the Kit-based DNA isolation methods produced the most consistent results. Using the MagNa Pure 24 automated platform, a large amount and high-quality DNA can be extracted, and well suited for monitoring changes in microbiome composition. We obtained the largest amount, but the worst quality DNA, using the conventional DNA isolation protocol. Nevertheless, this method has proven to be prominent for the in-depth analysis of microbiota communities. The greatest bacterial diversity is achieved with this method. Another goal of our research was to investigate the interactions between nutraceuticals rich in various bioactive components (carotenoids, fructooligosaccharides, symbiotics, anthocyanins) and the intestinal microbiota in broiler chickens. We concluded that the development of the animal exerted a great influence on the chicken microbial community structure. The use of nutraceuticals had a positive effect on the gut microbiome diversity of animals. Furthermore, treatment with nutraceuticals stimulated the growth of many beneficial SCFA-producing bacteria (Bifidobacteriaceae, Subdoligranulum, Faecalibacterium, Akkermansia, Butyricicoccus, Blautia, Ruminococcus) in the gut microbiome of chickens. We managed to reveal several positive and negative correlations between the microbial composition and weight gain. We showed that the amount of pathogenic Campylobacteriaceae, Helicobacteriaceae and Enterobacteriaceae decreased in the intestinal microbiome of animals treated with bioactive compound enriched nutraceuticals. Based on our results, we believe that nutraceutical treatment can be a promising solution to overcome health problems related to the overgrowth of intestinal bacteria and can potentially be alternative treatment strategies to replace and reduce the use of antibiotics.Tétel Szabadon hozzáférhető A Ty1 retrotranszpozon proteáz enzimatikus sajátságainak és humán tripszinek gátolhatóságának vizsgálata(2023) Gazda, Lívia Diána; Tőzsér, József; Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola; Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi KarTanulmányaim során két proteáz és azok inhibitorainak tanulmányozására nyílt lehetőségem. Az S. cerevisiae Ty1 retrotranszpozon-eredetű Ty1 proteáz His6 címkével jelölt és natív jelöletlen formáit BL21(DE3) E. coli baktérium törzsben termeltettük. A proteáz jellemzőit, biokémiai sajátosságait elsőként vizsgáltuk. A Ty1 proteáz legfontosabb sajátságai nagymértékben hasonlóak a retrovírus és retrovírus-szerű proteázokéhoz. Megállapítottuk a proteáz kinetikai paramétereit (KM, kcat, kcat/KM) különböző természetes hasítóhelyeket reprezentáló szubsztrátokra. Módosított szubsztrátokkal arra kerestük a választ, hogy a Ty1 proteáz esetében létezhet-e a korábban HIV-1 proteáz esetén azonosított felszíni szubsztrát kötő rész, azonban eredményeik alapján ez a Ty1 proteáz esetében nincs jelen. Vizsgáltuk az ionerősség, hőmérséklet, pH és urea koncentráció hatását az enzim aktivitására, az eredmények mind összehasonlíthatóak voltak a retrovírus-szerű proteázokra jellemző értékekkel. Továbbá vizsgáltuk a HIV1 proteáz és egyéb általános aszpartil proteáz gátlószerek hatását a Ty1 proteázra. Méréseink alapján, a proteáz természetes rezisztenciával rendelkezik a legtöbb HIV- 1 proteáz inhibitorral szemben. Munkánk során a vad típusú, illetve hét betegben azonosított SPINK1 variáns (N34S, N37S, K41N, I42M, P55S R65Q és Q68R) gátlási képességét vizsgáltuk szulfatált és nem- szulfatált humán tripszin izoformákon. A vad típusú és a mutáns SPINK1 fehérje változatok hatását a kötéserősségre az asszociációs és disszociációs állandók megállapításával vizsgáltuk. Amikor a vad típusú SPINK1 kötődését vizsgáltuk E. coli-ban termelt (nem-szulfatált) és hasnyálból tisztított tripszin (szulfatált) esetében, a kationos tripszin esetében 50-szeres, az anionos tripszin esetében több mint 120-szeres csökkenést mértünk a KD értékekben. Megvizsgáltuk a nem-szulfatált és szulfatált humán kationos tripszin átmeneti gátlását a vad típusú és a szakirodalomban hasnyálmirigy-gyulladással asszociált N34S SPINK1 variánssal. Nem figyeltünk meg jelentős eltérést a kötéserősségben vagy degradációban. Vizsgáltuk továbbá a SPINK1 fehérjében két mesterséges mutáció (Y43A és Y43R) hatását a szulfatált és nem-szulfatált kationos tripszin Y154-nel való kölcsönhatásra. A kötés erősségét a tripszinek szulfatációs állapota határozta meg, gyengítve vagy erősítve azt. Mindent összevetve, eredményeink arra engednek következtetni, hogy a SPINK1 inhibitor gyengébb kötődése a tripszin izoformákhoz elhanyagolható, nem kiváltó oka a hasnyálmirigy gyulladásnak, a betegség kialakulásához inkább az inhibitor csökkent expressziója és/vagy megváltozott foldingja járulhat hozzá.