Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez
Általános Orvostudományi Kar
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
(vezető: Dr. Balogh István)
Orvostudományi doktori tanács
D183
tudományág:
- elméleti orvostudományok
Böngészés
legfrissebb feltöltések
- TételSzabadon hozzáférhetőCitoszólikus szenzorok aktivitásának és szabályozó mechanizmusaiknak vizsgálata plazmacitoid dendritikus sejtekbenA NOD-szerű receptorok (NLR) az immunrendszer erősen konzervált citoszólikus mintázat felismerő receptorai (PRR), melyek multifunkcionális tulajdonságuk révén nemcsak a kórokozók és a szöveti sérülések veszély jeleinek felismerésében vesznek részt, hanem a sejt szinte minden funkciójára hatással vannak, kezdve az autofágiától a transzkripció aktivációjáig. Rendkívül fontos tulajdonságuk továbbá, hogy képesek más PRR-ek jelátviteli útvonalait szabályozni, illetve multiprotein inflammaszóma komplexeket képezhetnek, ezzel pedig meghatározhatják mind az antibakteriális, mind az antivirális immunválasz kimenetelét. A plazmacitoid dendritikus sejtek (pDS) szervezetünk professzionális I-es típusú interferon (IFN) termelő sejtjei, melyek nagymértékű IFN termelő képességük révén egyedülálló antivirális aktivitással bírnak, ugyanakkor az autoimmun folyamatok patogenezisében is szerepet játszanak, így fontos terápiás célpontok. Azonban a pDS-ekben a citoszólikus PRR-ek szerepe és szabályozó mechanizmusaik kevésbé feltártak. Így kutatásunk célja az volt, hogy a humán pDS-ekben is megvizsgáljuk a különböző NLR-ek szabályozó receptor interakcióit, illetve az inflammaszóma formáló képességüket. Kimutattuk, hogy az NLRX1 és az NLRC5 negatívan szabályozza a RIG-I-szerű receptorok (RLR) közvetített I-es típusú IFN termelést a pDS-ekben és a monocita eredetű dendritikus sejtekben (moDS) is, míg a pro-inflammatórikus citokin választ csak az NLRX1 gátolja és csak a moDS-ekben. Ezen eredményeink azt mutatják, hogy a sejtspecifikus hatás mellett, a regulatórikus NLR-ek főként azon sejtfunkciók esetében szolgálhatnak negatív visszacsatolási mechanizmusként, melyek jelentős mértékben meghatározzák az adott sejt profilját. Bizonyítottuk továbbá, hogy a regulatórikus NLR-ek mellett az NLRP3 inflammaszóma is funkcionál a pDS-ekben. Eredményeink alapján erős NF-κB induktorokra és specifikus másodlagos, az inflammaszómát aktiváló jelekre is szükség van pDS-ekben a biológiailag aktív, érett IL-1β szekréció kiváltásához. Azonban az NLRP3-függő IL-1β szekréciós útvonal csak olyan gyulladásos körülmények között lehet aktív a pDS-ekben, melyekben az I-es típusú IFN útvonal aktivitás nem dominál, mivel a magas I-es típusú IFN szinttel járó állapotok számos NLRP3 gátló fehérjének az expresszióját fokozzák. Munkánk során tehát sikerült új receptor interakciókat, illetve inflammaszóma aktivitást feltárnunk egy olyan sejttípusban, melynek szerepe számos patológiás állapotban ismert. A pDS-ek és az NLR-ek nem megfelelő működése is lényeges kóroki tényezőnek minősül a fertőzések kimenetelét, illetve az autoimmun folyamatok kialakulását illetően, ezért a pDS-ek citoszólikus receptorainak és szabályozó mechanizmusaiknak átfogóbb megismerése új célpontokkal szolgálhat számos kórkép terápiás eljárásainak hatékonyabbá tételéhez.
- TételSzabadon hozzáférhetőFluoreszcenciás módszerek kidolgozása ABC transzporterek katalitikus ciklusának vizsgálatára és hal hibridek ploiditásának meghatározásáraA humán ABCG2 és a P-glikoprotein (Pgp, ABCB1) elsődlegesen aktív, exporter típusú ABC transzporterek, melyek számos főként hidrofób vagy amfipatikus xeno- és endobiotikumot képesek eltávolítani a sejtekből, mint például kemoterápiás szereket és toxikus metabolikus melléktermékeket. Tumorsejtekben (ABCG2, Pgp) vagy tumor őssejtekben (ABCG2) expresszálódva multidrog rezisztenciát okozhatnak, mely gyakran hozzájárul a daganatok eliminálását célzó kemoterápia sikertelenségéhez. Mindkét fehérje főként a szervezet barrier-funkciókkal rendelkező szöveteiben expresszálódik, beleértve a vér-agy gátat, a vér-here gátat, a beleket, a májat, a méhlepényt, a veséket és az emlőmirigyeket. Szöveti lokalizációjuk, valamint széles szubsztrát-spektrumuk miatt fontos szerepet játszanak a különböző betegségek kezelésére használt gyógyszerek felszívódásában, szervezeten belüli eloszlásában, eliminációjában és toxicitásában (ADME-Tox). Másrészt a genetikai polimorfizmusok, amelyek az ABCG2 vagy az ABCB1 expressziójának csökkenését és/vagy működésének károsodását eredményezik, megváltozott terápiás választ és a gyógyszeres kezeléssel összefüggő toxikus reakciókat okozhatnak. Mivel az ABCG2 a húgysav eliminációs útvonalának is kulcsszereplője, csökkent expressziója vagy működése hiperurikémiát és köszvényt okozhat. Fiziológiás funkcióik és betegségek patomechanizmusában, valamint a gyógyszer rezisztencia kialakulásában betöltött szerepük miatt fontos gyógyszer célpontok, mely szükségessé teszi működési mechanizmusuk részletes megismerését.
- TételSzabadon hozzáférhetőA HIF-1 útvonal aktiváció szerepe a vaszkuláris kalcifikáció patomechanizmusábanA vaszkuláris kalcifikáció egy komplex, a vaszkuláris simaizomsejtek, valamint számos induktor és inhibitor közreműködésével zajló aktív folyamat, melynek során bekövetkezik a vaszkuláris simaizomsejtek oszteokondrogén irányú differenciálódása. A kalcifikációs mikrokörnyezet gyakran hipoxiássá válik, ezért munkánk során a hipoxia hatását vizsgáltuk vaszkuláris simaizomsejtek oszteokondrogén irányú differenciálódására. Kimutattuk, hogy a hipoxia fokozza a vaszkuláris simaizomsejtek hipoxia által indukált HIF-1α és célfehérjéinek, valamint az oszteokondrogenikus markerek expresszióját és az extracelluláris mátrix kalcifikációját. Kimutattuk, hogy a hipoxia fokozza a vaszkuláris simaizomsejtek mitokondriális ROS termelődését. A HIF-1 útvonal chetominnal történő gátlása csökkenti a Vaszkuláris simaizomsejtek hipoxia által indukált oszteokondrogén irányú differenciálódását, az extracelluláris mátrix kalcifikációját és a ROS termelést. Megállapítottuk, hogy ROS szkevendzserek jelenlétében elmaradt a vaszkuláris simaizomsejtek hipoxia által indukált oszteokondrogén irányú átprogramozódása és extracelluláris mátrix kalcifikációja. Ex vivo szövettenyészetben tovább vizsgálódva kimutattuk, hogy a hipoxia fokozza az egér aorta kalcifikációját, mely ROS és HIF-1 inhibitorokkal gátolható. Eredményeink arra utalnak, hogy a hipoxia fokozza a vaszkuláris simaizomsejtek oszteokondrogén irányú differenciálódását, mely hatásban a HIF-1 útvonal aktivációja és a mitokondriális ROS termelődésének fokozódása játszik szerepet. A krónikus vesebetegséghez gyakran társul anémia. A Daprodustat egy prolil-hidroxiláz enzim inhibitor, mely a krónikus vesebetegség-asszociált anémia kezelésére kifejlesztett újgenerációs szerek egyike. Korábbi tanulmányok kimutatták a HIF-1 aktiváció és a vaszkuláris kalcifikáció közötti kapcsolatot, ezért a DPD foszfáttal-indukált kalcifikációt fokozó hatását vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a DPD aktiválja a HIF-1 útvonalat és fokozza a Vaszkuláris simaizomsejtek magas foszfáttal indukált kalcifikációját. A HIF-1 útvonal farmakológiai vagy a HIF-1α expressziójának csökkentése általi gátlása megakadályozza a DPD pro-kalcifikációs hatását. A DPD kalcifikációt fokozó hatását ex vivo egér aorta szövettenyészetben is kimutattuk. A DPD kalcifikációra gyakorolt hatását in vivo körülmények között is vizsgáltuk adeninnel indukált krónikus vesebetegség egérmodellben. Kimutattuk, hogy a DPD kezelés megelőzi az anémia kialakulását CKD egerekben, ugyanakkor fokozza az aorta kalcifikációt. A HIF-1 útvonal aktiváció pro-kalcifikációs hatásának ismerete olyan klinikai tanulmányokat sürget, melyekben az új generációs hipoxia mimetikumok kardiovaszkuláris rizikóra gyakorolt hatása felmérhető
- TételSzabadon hozzáférhetőBioaktív komponensekben gazdag nutraceutikumok hatásának vizsgálata broiler csirke tápcsatorna mikrobiomra újgenerációs szekvenálássalA mikrobiom tagjai (vírusok, gombák, baktériumok) az egész szervezetet benépesítik, megtalálhatók a felső légutakban, bőrön és a GIT-ben. Alapvetően a legtöbb mikroba a gazdaszervezettel szimbiotikus kapcsolatban él, megvédik a szervezetet a patogén mikroorganizmusok behatolásától, ezenkívül számos más a gazdaszervezet szempontjából hasznos funkciót is betöltenek. A bél-mikrobióta egyensúlya a gazdaszervezet számára számos előnnyel jár, míg egyensúlyának megbomlása számos anyagcserével és immunrendszerrel összefüggő betegség kialakulásához vezet. Noha a bél-mikrobiom funkciója, összetétele alaposan tanulmányozott, az eddigi eredmények csupán részben fedik le e hatalmas területet, számtalan kérdés megválaszolatlan maradt. A bél-mikrobiom működésének a gazdaszervezetre kifejtett hatásának pontos megismeréséhez kiemelkedő fontosságú összetételének alapos ismerete. Napjainkban az új-generációs szekvenáláson alapuló technikák (NGS) alkalmazása egyre nagyobb teret hódítanak a mikrobiális összetétel vizsgálatok során. NGS használatával lehetőségünk nyílik arra, hogy információt kapjunk a klasszikus mikrobiológiával, tenyésztéses módszerrel nem vizsgálható mikroorganizmusokról és azok tulajdonságairól. Azonban a kapott eredményt számos egymást követő módszer összessége határozza meg. Munkám egyik célja volt, hogy meghatározzam a különböző technikai torzító tényezők hatásait a 16 S rRNS gén amplikon szekvenálás eredményére. Két mintahomogenizáló módszert vizsgáltunk a direkt lízist (DL) és a bakteriális sejtszúszpenziót (BS). Kimutattuk, hogy a DL alkalmazásával nagyobb DNS kihozatal érhető el, azonban ezzel a módszerrel gyengébb minőségű DNS-t kaptunk, mint a BS esetében. Megállapítottuk, hogy a BS nagyobb alfa diverzitási és szekvenálási mutató értékeket eredményezett. A DL alkalmazásával nagyobb mennyiségben nyerhetők ki a Gram-pozitív baktériumok, míg a BS esetében kiegyensúlyozott Gram profilokat kaptunk. Összehasonlítottuk a különböző sejtfeltáró és DNS izoláló módszereket. Kimutattuk, hogy a mechanikai és kémiai lízisek kombinációjával érhető el a legnagyobb alfa diverzitási mutató. Eredményeink alapján elmondható továbbá, hogy a kit alapú DNS izolálási módszerek eredményezték a legkonzisztensebb eredményt. A MagNa Pure 24 automatizált platform alkalmazásával nagy mennyiségű és jó minőségű DNS nyerhető ki, standardizálható eljárás, jól alkalmazható mikrobiom összetételben bekövetkező változások nyomon követésére. A konvencionális DNS izolálási eljárással nyertük ki a legnagyobb mennyiségű, azonban legrosszabb minőségű DNS-t. Mindazonáltal ez a módszer kiemelkedőnek bizonyult a mikrobióta közösségek mélyreható elemzésére. Ezzel a módszerrel érhető el a legnagyobb bakteriális diverzitás. Jelenleg a tudományos érdeklődés középpontjában olyan terápiás stratégiák kidolgozása áll, amelyek az állati és emberi bél-mikrobiomot alkotó egyes mikrobákat célozzák meg, ami által az egyensúlyi mikrobiom helyreállítható, illetve fentarthat. Munkám másik fő célja, a különböző bioaktív komponensekben gazdag nutraceutikumok (karotinoidok, fruktooligoszacharidok, szimbiotikumok, antocianinok) és a bél-mikrobióta közötti kölcsönhatások vizsgálata volt broiler csirkében. Megállapítottuk, hogy az állomány fejlődése során lényegesen változott a bél-mikrobiom összetétele. A nutraceutikumok alkalmazása pozitív hatást fejtett ki az állatok bél-mikrobiom diverzitására. Továbbá a nutraceutikumokkal történő kezelés serkentette számos jótékony SCFA termelő baktérium (Bifidobacteriaceae, Subdoligranulum, Faecalibacterium, Akkermansia, Butyricicoccus, Blautia, Ruminococcus) mennyiségét a csirkék bél-mikrobiomjában. Munkánk során számos pozitív és negatív korrelációt sikerült feltárnunk a mikrobiális összetétel és súlygyarapodás között. Kimutattuk, hogy a patogén Campylobacteriaceae, Helicobacteriaceae és Enterobacteriaceae mennyisége csökkent a nutraceutikum kezelést kapott állatok bél-mikrobiomjában. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a nutraceutikum kezelés ígéretes megoldás lehet bizonyos bélbaktériumok túlszaporodásával kapcsolatos egészségügyi problémák leküzdésére és potenciálisan alternatív kezelési stratégiák lehetnek az antibiotikumok alkalmazásának helyettesítésére, csökkentésére. A jövőben a mikrobiom kutatások izgalmas perspektívákat kínálnak mind az állattenyésztési alkalmazások mind a különböző humán patológiás folyamatok (például cukorbetegség, magasvérnyomás, gyulladásos bélbetegség) kezelésének kifejlesztésével szemben. Microbes are present everywhere. Countless symbiotic, pathogenic, and commensal microbes colonize human, animal, and plant organisms, which together constitute the microbiome. The widespread use of next-generation sequencing (NGS) technologies has led to an explosion of interest in understanding the microbiome. With the advent of NGS technologies, it has become possible to comprehensively map the individual members of a given microbiome and to investigate how microbial communities function and influence host-pathogen interactions. The various NGS methods have their own technical pitfalls, which can affect the obtained sequencing results. In the first part of our experiments, we aimed to investigate the effects of various technical distortion factors on the results of 16 S rRNA gene amplicon sequencing. Two sample homogenization methods were investigated direct direct lysis (DL) and indirect bacterial cell suspension (BS). We have shown that a higher DNA yield can be obtained by using DL, however with this method we obtained lower quality DNA than in the case of BS. We found that BS resulted in higher alpha diversity and sequencing index values. Gram-positive bacteria can be recovered in larger amount using DL, while balanced Gram profiles were obtained in the case of BS. We compared different cell lyses and DNA isolation methods. We have revealed that the combination of mechanical and chemical lysis achieves the highest alpha diversity index. We observed that the Kit-based DNA isolation methods produced the most consistent results. Using the MagNa Pure 24 automated platform, a large amount and high-quality DNA can be extracted, and well suited for monitoring changes in microbiome composition. We obtained the largest amount, but the worst quality DNA, using the conventional DNA isolation protocol. Nevertheless, this method has proven to be prominent for the in-depth analysis of microbiota communities. The greatest bacterial diversity is achieved with this method. Another goal of our research was to investigate the interactions between nutraceuticals rich in various bioactive components (carotenoids, fructooligosaccharides, symbiotics, anthocyanins) and the intestinal microbiota in broiler chickens. We concluded that the development of the animal exerted a great influence on the chicken microbial community structure. The use of nutraceuticals had a positive effect on the gut microbiome diversity of animals. Furthermore, treatment with nutraceuticals stimulated the growth of many beneficial SCFA-producing bacteria (Bifidobacteriaceae, Subdoligranulum, Faecalibacterium, Akkermansia, Butyricicoccus, Blautia, Ruminococcus) in the gut microbiome of chickens. We managed to reveal several positive and negative correlations between the microbial composition and weight gain. We showed that the amount of pathogenic Campylobacteriaceae, Helicobacteriaceae and Enterobacteriaceae decreased in the intestinal microbiome of animals treated with bioactive compound enriched nutraceuticals. Based on our results, we believe that nutraceutical treatment can be a promising solution to overcome health problems related to the overgrowth of intestinal bacteria and can potentially be alternative treatment strategies to replace and reduce the use of antibiotics.
- TételSzabadon hozzáférhetőA Ty1 retrotranszpozon proteáz enzimatikus sajátságainak és humán tripszinek gátolhatóságának vizsgálataTanulmányaim során két proteáz és azok inhibitorainak tanulmányozására nyílt lehetőségem. Az S. cerevisiae Ty1 retrotranszpozon-eredetű Ty1 proteáz His6 címkével jelölt és natív jelöletlen formáit BL21(DE3) E. coli baktérium törzsben termeltettük. A proteáz jellemzőit, biokémiai sajátosságait elsőként vizsgáltuk. A Ty1 proteáz legfontosabb sajátságai nagymértékben hasonlóak a retrovírus és retrovírus-szerű proteázokéhoz. Megállapítottuk a proteáz kinetikai paramétereit (KM, kcat, kcat/KM) különböző természetes hasítóhelyeket reprezentáló szubsztrátokra. Módosított szubsztrátokkal arra kerestük a választ, hogy a Ty1 proteáz esetében létezhet-e a korábban HIV-1 proteáz esetén azonosított felszíni szubsztrát kötő rész, azonban eredményeik alapján ez a Ty1 proteáz esetében nincs jelen. Vizsgáltuk az ionerősség, hőmérséklet, pH és urea koncentráció hatását az enzim aktivitására, az eredmények mind összehasonlíthatóak voltak a retrovírus-szerű proteázokra jellemző értékekkel. Továbbá vizsgáltuk a HIV1 proteáz és egyéb általános aszpartil proteáz gátlószerek hatását a Ty1 proteázra. Méréseink alapján, a proteáz természetes rezisztenciával rendelkezik a legtöbb HIV- 1 proteáz inhibitorral szemben. Munkánk során a vad típusú, illetve hét betegben azonosított SPINK1 variáns (N34S, N37S, K41N, I42M, P55S R65Q és Q68R) gátlási képességét vizsgáltuk szulfatált és nem- szulfatált humán tripszin izoformákon. A vad típusú és a mutáns SPINK1 fehérje változatok hatását a kötéserősségre az asszociációs és disszociációs állandók megállapításával vizsgáltuk. Amikor a vad típusú SPINK1 kötődését vizsgáltuk E. coli-ban termelt (nem-szulfatált) és hasnyálból tisztított tripszin (szulfatált) esetében, a kationos tripszin esetében 50-szeres, az anionos tripszin esetében több mint 120-szeres csökkenést mértünk a KD értékekben. Megvizsgáltuk a nem-szulfatált és szulfatált humán kationos tripszin átmeneti gátlását a vad típusú és a szakirodalomban hasnyálmirigy-gyulladással asszociált N34S SPINK1 variánssal. Nem figyeltünk meg jelentős eltérést a kötéserősségben vagy degradációban. Vizsgáltuk továbbá a SPINK1 fehérjében két mesterséges mutáció (Y43A és Y43R) hatását a szulfatált és nem-szulfatált kationos tripszin Y154-nel való kölcsönhatásra. A kötés erősségét a tripszinek szulfatációs állapota határozta meg, gyengítve vagy erősítve azt. Mindent összevetve, eredményeink arra engednek következtetni, hogy a SPINK1 inhibitor gyengébb kötődése a tripszin izoformákhoz elhanyagolható, nem kiváltó oka a hasnyálmirigy gyulladásnak, a betegség kialakulásához inkább az inhibitor csökkent expressziója és/vagy megváltozott foldingja járulhat hozzá.