A szakdolgozatom célkitűzése az volt, hogy két új, szekvenciájában módosított PAF termelésére alkalmas expressziós törzset hozzak létre. A tervezett módosítás mindkét esetben egy az antifungális hatás szempontjából neutrálisnak ítélt aminosav cseréje volt ciszteinre. Tehát a következő két új PAF változat létrehozását tűztük ki célul:

• PAF_A1C: melyben az érett fehérje N-terminálisának az egyes pozíciójában lévő alanin aminosavat ciszteinre cseréljük
• PAF_S10C: melyben az érett fehérje N-terminálisának tízedik pozíciójában levő szerin aminosavát cseréljük ciszteinre Ahhoz, hogy a P. chrysogenum paf génjébe be tudjam vinni a tervezett mutációkat, PCR-alapú helyspecifikus mutagenezis módszert alkalmaztam. Első lépésben a PAF_A1C variánst hoztam létre, majd ezután a PAF_S10C variáns követezett. Mindkét variáns esetében 3-3 PCR reakciót végeztem el ahhoz, hogy a kívánt aminosav cseréket kapjam eredményül. A PCR reakciók során olyan primereket használtam, melyek tartalmazzák azokat a lecserélt nukleotidokat, melyek ciszteint kódolnak. A következő lépés a mutációt tartalmazó fragmentum bevitele volt a megfelelő expressziós vektorba, a pSK275pafA plazmidba. Kolónia-PCR-rel, kontroll emésztéssel és szekvenálással is ellenőriztem mindkét variáns esetében, hogy valóban a helyes mutációt vittem-e be a pafA génbe. A szekvenálás eredményei a kívánt mutációkat mutatták. Mivel a DNS koncentráció kellően magas volt (A1C variáns esetében: 350-460 ng/μl, míg S10C variáns esetében: 1100-1600 ng/μl), a P. chrysogenum-ba való transzformálást elvégezhettem, amihez a megfelelő P. chrysogenum Δpaf4 expressziós törzset használtam. Ahhoz, hogy bármilyen gombába transzformálhassunk, a sejtfalat el kell távolítani valamilyen eljárással, én a protoplasztálás módszerét alkalmazva juttattam be és szaporítottam fel a módosított plazmidokat Penicillium chrysogenum-ba.