ÖSSZEFOGLALÁS

BEVEZETÉS: A XIII-as véralvadási faktor (FXIII) egy tetramer szerkezetű fehérje (FXIII-A2B2), mely két katalitikus A (FXIII-A) és két hordozó/gátló B (FXIII-B) alegységből áll. A véralvadásban alapvető funkciója a képződött fibrinszálcsák stabilizálása és fibrinolízistől való védelme. Emellett a FXIII a sebgyógyulásban és az érújdonképződésben is részt vesz. Utóbbi funkciói a plazma mellett az extravasculáris folyadékterekben is fontosak lehetnek. CÉLKITŰZÉSEK: Igen érzékeny kemilumineszcens ELISA módszerek kidolgozása a FXIII alegységek és komplex mennyiségi meghatározására, és ezek segítségével meghatározni a FXIII komponensek koncentrációját humán könnyben. A továbbiakban célunk volt a FXIII koncentrációk mérése stimulált könnyben ill. perforáló keratoplasztikát követően. MÓDSZEREK: Nagy érzékenységű kemilumineszcens ELISA módszereket fejlesztettünk ki a könnyben kis koncentrációban jelen lévő FXIII-A, FXIII-B és FXIII-A2B2 antigénszintek mérésére. 60 egészséges önkéntes nem-stimulált és stimulált könnymintáiban, valamint 31 perforáló keratoplasztikán (PKP) átesett beteg könnymintáiban a műtét előtt és azt követően 1 hétig mértük a FXIII koncentrációkat. Közülük 23 beteget 18 hónapig rendszeresen követtünk, a cornea ereződését is vizsgáltuk. EREDMÉNYEK: Mindhárom ELISA esetében a minimális mérési határ 0,02 μg/L alatt volt, a módszerek összegzett pontatlansága (laboratóriumon belüli hiba) alacsony koncentrációk esetén sem érte el a 12%-ot, a sorozaton belüli hiba pedig 5.5% alatt volt. A tesztekben a FXIII alegységek és a FXIII komplex visszanyerése közel 100% volt. A mérési tartományokban a másodfokú polinomiális kalibrációs görbék kiváló illeszkedést mutattak. Egészséges, nem stimulált könnymintákban állandó, alacsony koncentrációban szabadon megtalálható a FXIII-A és FXIII-B, az alegységek a plazmához viszonyítva erősen csökkent arányban képeznek komplexet. Stimuláció hatására szekretálódott könnyben a FXIII koncentrációk valamelyest csökkentek, de a mért értékeket össz-fehérje tartalomra normalizálva a koncentrációk nem változtak. 24 órával PKP-t követően a könny FXIII-A koncentrációja 10,4-szeresére, FXIII-B koncentrációja 9,4-szeresére, FXIII-A2B2 koncentrációja pedig 20,5-szeresére emelkedett. A totál protein koncentrációra vonatkoztatott FXIII szintek még nagyobb emelkedést mutattak. Az első napot követően a FXIII koncentrációk lassan csökkentek, de még 7 nappal a műtét után is szignifikánsan magasabbak voltak, mint a műtét előtt. A FXIII szintek PKP-t követő emelkedése szignifikánsan nagyobb volt azoknál a betegeknél, akiknél a donor szaruhártya a 18 hónapos követési periódusban beereződött. KÖVETKEZTETÉS: A FXIII a könny-proteóma alacsony koncentrációjú, de érzékeny kemilumineszcens ELISA-val jól mérhető komponense. A tény, hogy a FXIII mennyisége PKP után megemelkedik, felveti szerepét a szaruhártya sebgyógyulásának folyamatában. Az igen magas FXIII szintek azonban összefügghetnek a transzplantátum későbbi ereződésével.

SUMMARY

BACKGROUND: Blood coagulation factor XIII is a tetramer (FXIII-A2B2) consisting of catalytic A (FXIII-A) and carrier/protective B (FXIII-B) subunits. Beside stabilizing fibrin and protecting it from fibrinolysis, FXIII is also involved in wound healing and angiogenesis. Its latter functions could be important in body fluids other than the blood. AIMS OF THE STUDY: To develop highly sensitive chemiluminescent ELISAs for the measurement of FXIII subunits and their complex and using these methods to determine FXII concentrations in human tears. It was also our aim to measure FXIII concentrations in stimulated tears and in tears collected before and after penetrating keratoplasty (PKP). METHODS: Highly sensitive chemiluminescent ELISAs were developed to measure low FXIII-A, FXIII-B and FXIII-A2B2 antigen concentrations in tiny volumes of tear. Tear samples were collected from 60 healthy volunteers before or after the stimulation of tear secretion. FXIII concentrations were also measured in tears of 31 patients before and after PKP. RESULTS: For all three assays the limit of quantitation was below 0.02 µg/L, within laboratory imprecision did not exceed 12% even at low concentrations, within run imprecision was under 5.5%. The recovery of the FXIII subunits and complex was close to 100% in the assays. The calibration curves showed an excellent fitting using second order polynomial equation. In non-stimulated tears from healthy volunteers a low, but consistent amount of FXIII-A and FXIII-B was measured, mostly in free uncomplexed form. Following stimulation of tear secretion, FXIII levels moderately decreased, but if normalized to total protein concentration they did not change. 24 hours after PKP FXIII-A, FXIII-B and FXIII-A2B2 levels became highly elevated (10.4-fold, 9.4-fold and 20.5-fold, respectively). FXIII levels normalized to total protein concentrations showed even higher elevations. After the first day, FXIII concentrations gradually decreased, but even on day 7 significantly exceeded pre-surgery levels. The elevation of tear FXIII levels was significantly higher in PKP patients who later developed neovascularization of donor cornea during the 18 months follow-up period than in PKP patients whose cornea remained transparent. CONCLUSIONS: FXIII-A and FXIII-B are low concentration components of tear proteome, but it can be measured with our hypersensitive chemiluminescent ELISA methods. The fact that their levels become highly elevated after PKP suggests the involvement of FXIII in the healing of corneal wound. However, perioperatively measured high FXIII levels in tears seem to represent a risk of neovascularization.