Feszültségkapuzott ioncsatornák és ceramidok kapcsolatának vizsgálata

Abstract

A feszültségkapuzott ioncsatornák és a lipidek közötti kapcsolat kétirányú. Egyrészt transzmembrán fehérjék révén az aktivációs kapuzás során az ioncsatornában végbemenő nagy szerkezeti átrendeződéseket a sejtmembrán lipidjei képesek befolyásolni. Másrészt az ioncsatornák számos sejtélettani folyamatot modulálnak, ezáltal közvetve a sejt lipidszintjeit is képesek finomhangolni. Bár a ceramidok igen fontos élettani és kórélettani szereppel bírnak, feszültségkapuzott ioncsatornákkal fennálló potenciális kapcsolataikat korábban részletesen nem tanulmányozták. A disszertáció első felében azt vizsgáltuk, hogy a C16-ceramid (Cer) és C16-glükozilceramid (GlcCer) hogyan befolyásolja a KV1.3 ioncsatorna aktivációs kapuzását. Kételektródás voltage-clamp fluorimetria segítségével azt találtuk, hogy a sejtek exogén töltését követően mindkét lipid hasonló, gátló jellegű hatásokat fejt ki a csatorna pórusdoménjét (PD) jellemző paraméterekre, míg a feszültségszenzor domén (VSD) mozgására csak a Cer van hasonló hatással. Ez a két lipid ioncsatornán belüli eltérő támadáspontjára utal, a Cer ugyanis elsődlegesen a VSD-t, míg a GlcCer a PD-t targetálja. Lokális környezeti paraméterekre szenzitív próbák és fluoreszcencia alapú módszerek segítségével kimutattuk, hogy míg a Cer és a GlcCer hasonlóan növeli a molekuláris rendezettséget a lipidkettősréteg belső, hidrofób régióiban, addig a Cer egyedülálló módon erőteljes molekuláris átrendeződést indukál a membrán-víz határfelületen, ahol a depolarizáció során a VSD-ben található, pozitívan töltött aminosavakat tartalmazó S4 szegmentumnak a membrán síkjából kifelé történő elmozdulása történik. Ez az eltérő membránbiofizikai hatás magyarázhatja a Cer GlcCer-tól különböző, elsődlegesen VSD-t targetáló hatásmechanizmusát. A disszertáció második felében arra mutattunk rá áramlási citometria segítségével, hogy a legszélesebb körben alkalmazott HV1 protoncsatorna gátlószer, az 5-klór-2-guanidinobenzimidazol (ClGBI) biológiailag releváns dózisokban csökkenti a human THP-1-eredetű polarizált makrofágok életképességét, oly módon, hogy az M1-makrofágok a legérzékenyebbek, az M2-sejtek pedig a legkevésbé érzékenyek erre a vegyületre. A ClGBI HV1 gátláson keresztüli specifikus hatásait jelzi, hogy a polarizált makrofágok érzékenysége jól korrelál a sejtek HV1 expressziós szintjével, valamint más, makrofágokon releváns ioncsatorna gátlószerek közül egyedül egy másik HV1 gátló, a Zn2+ fejtett ki hasonló hatásokat. Eredményeink arra is rávilágítanak, hogy a csatorna gátlása elsősorban a pH-érzékeny savas szfingomielináz működésén keresztül a ceramidok túlzott termelődéséhez vezet, ami végül sejthalált indukál.

The relationship between voltage-gated ion channels and lipids is bidirectional. On the one hand, ion channels are transmembrane proteins, therefore, major structural rearrangements resulting in activation are subject to modulatory actions by the lipids of the cell membrane. On the other hand, ion channels can influence numerous cellular processes, thereby indirectly fine-tuning cellular lipid levels. Although ceramides play very important physiological and pathophysiological roles, their potential interactions with voltage-gated ion channels have not been previously studied in detail. In the first part of the dissertation, we investigated how C16-ceramide (Cer) and C16-glycosylceramide (GlcCer) influence the activation gating of the KV1.3 ion channel. Using two-electrode voltage-clamp fluorimetry, we found that following exogenous loading of the cells, both lipids exert similar, inhibitory effects on parameters characterizing the channel’s pore domain (PD), while only Cer has a similar effect on voltage-sensor domain (VSD) movement. These suggest that the two lipids have distinct intramolecular targets within the ion channel, namely Cer primarily targets the VSD, while GlcCer the PD. Using environment-sensitive fluorophores and fluorescence-based methods, we demonstrated that while Cer and GlcCer similarly increase molecular order in the inner hydrophobic regions of the lipid bilayer, Cer uniquely induces a strong molecular rearrangement at the membrane-water interface, where, during depolarization, the S4 segment of the VSD, containing positively charged amino acids, slides outward from the plane of the membrane. This distinct membrane biophysical effect may explain the unique mechanism of action of Cer, which differs from that of GlcCer, by primarily targeting the VSD. In the second part of the dissertation, we demonstrated using flow cytometry that the most widely used HV1 proton channel inhibitor, 5-chloro-2-guanidinobenzimidazole (ClGBI), reduces the viability of polarized macrophages derived from human THP-1 cells at biologically relevant doses, with M1 macrophages being the most sensitive and M2 cells the least sensitive to effects of the compound. The specific effects of ClGBI mediated by HV1 inhibition are indicated by the fact that the sensitivity of polarized macrophages correlates well with the HV1 expression levels of the cells. Furthermore, among other ion channel inhibitors relevant to macrophages, only Zn2+, another HV1 inhibitor, exhibited similar effects. Our results also highlight that inhibition of the channel results in excessive ceramide production via the action of the pH-sensitive acidic sphingomyelinase, which eventually culminates in cell death.